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摘要目的： 1．设计、构建携带siNgR199慢病毒重组体。 2．在细胞水平探讨慢病毒重组体沉默NgR基因的效应及最佳给药剂量。 3．在动物模型水平探讨慢病毒重组体沉默NgR基因对大鼠SCI后神经轴突再生和神经功能的影响，为进一步应用临床试验提供理论依据。 方法： 1．按照Elbashir等设计原则和siRNA表达载体的要求，设计构建NgR特异siNgR199慢病毒重组体，并进行酶切鉴定及基因测序； 2．体外培养大鼠原代皮层神经元细胞，1周后进行不同滴度的重组慢病毒转染，通过荧光镜观察重组体转染情况，确定最适转染的慢病毒重组体MOI值，并应用实时荧光定量PCR检测内源性Nga基因沉默效果； 3．采用改良Allen’s打击法建立大鼠中度脊髓损伤模型； 4．36只成年雌性SD大鼠随机分为生理盐水组、空慢病毒组、重组慢病毒组(各12只)，脊髓损伤后1周行皮层体感运动区多点注射给药，给药8d后应用实时荧光定量PCR检测注谢区皮层神经元细胞NgR mRNA表达情况，免疫组化观察NgR蛋白表达状况。 5．36只成年雌性SD大鼠随机分为生盐水组、空慢病毒组、重组慢病毒组(各12只)，脊髓损伤后1周行皮层体感运动区多点注射，在脊髓损伤后每周，对大鼠的神经功能进行行为学评分；给药后6周行皮层体感运动区注射神经示踪剂，给药后8周通过组织学观察脊髓损伤神经修复情况。 结果： 1．构建的NgR特异性siNgR199慢病毒重组体经酶切鉴定、基因测序仪测序，结果与设计序列完全相符，目的基因序列准确无误，慢病毒重组体构建成功。 2．慢病毒重组体实现大鼠原代皮层神经元转染，96h后神经细胞开始表达绿色荧光，146h后绿色荧光最强，适合高效感染的MOI值为3；转染192h后收集细胞进行实时荧光定量PCR检测，结果显示目的基因抑制效率为61％，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。 3.在改良Allen's大鼠脊髓损伤模型中行皮层体感运动区分点注射给药，给药8d后取注射区脑组织进行实时荧光定量PCR检查NgR表达水平，结果显示，重组慢病毒注射组与生理盐水注射组及空慢病毒注射组比较有统计学意义(P<0.01)；注射区脑组织切片进行免疫组化检查NgR蛋白表达情况，生理盐水组及空慢病毒组可见清晰阳性细胞，重组慢病毒组NgR染色阳性颗粒减少，从而说明在活体内大脑皮层注射慢病毒重组体转染后实现了NgR基因的沉默。 4.大鼠脊髓损伤后每周行BBB评分，所有实验大鼠在损伤后第1天都表现为丧失所有后肢运动，BBB评分均为O分，但损伤后1周内未给药情况下可自然恢复至BBB评分平均为8分水平，损伤后3周内恢复的幅度较大，损伤3周后(给药2周后)恢复减慢，但损伤5周后(给药4周后)重组慢病毒组恢复情况明显好于空慢病毒组及生理盐水组；虽然各实验组SCI大鼠的神经功能均有一定程度的神经恢复，但重组慢病毒组和生理盐水组及空慢病毒组之间神经功能评分结果差异显著(P<0.01)，生理盐水组和空慢病毒组之间神经功能评分结果无明显差异(P>0.05)。组织学和神经纤维染色检查结果：重组慢病毒组损伤部位形成的空洞比较少，可观察到神经纤维通过、有更多髓鞘组织形成及胶质细胞增生；神经示踪观察重组慢病毒组有少量的轴突生长通过损伤区域。 结论： 本研究成功构建了NgR特异性siNgR199慢病毒重组体，重组体能够在大鼠体外培养的原代皮层神经元和体内脊髓损伤模型中实现RNA干扰，较长时间下调神经元的内源性NgRmRNA表达，并在一定程度上促进脊髓神经轴突再生和大鼠后肢运动功能的恢复。我们认为慢病毒载体介导的RNA干扰可能成为脊髓损伤治疗的有效手段之一，其可能的作用机制为：慢病毒重组体能稳定地在皮层神经元中表达RNA干扰，长期诱导NgR基因沉默，从而减少髓磷脂相关抑制因子Nogo、MAG和Omgp与NgR结合，最终能够促进脊髓损伤区神经轴突的再生。