检索历史 清除

摘要背景与目的 大肠癌(Colorectal adenocarcinoma，CRC)发病率和死亡率居全球恶性肿瘤第三位和第四位。在发达国家发病率居恶性肿瘤第二位，为5％。当病变还局限在肠壁时外科手术是治疗的基础，70％-80％的病人通过病灶的切除得以治愈。外科治疗后，病灶局限的病人5年生存率为90％，而假如有了淋巴结转移5年生存率则减为65％，因此对大肠癌的早期检测是提高生存率最有效的办法。 现在多认为大肠癌由正常粘膜转化为癌前病变腺瘤然后成为大肠癌是由一系列基因改变而引起。在肿瘤研究中，生物标志物可提示体内癌症的存在。大多数生物标志物基于基因突变或RNA、蛋白和代谢产物的异常改变，因此可用于检测早期大肠癌，以及预测疾病预后、监控疾病过程和对治疗的反应。 近年发现了一个新的膜蛋白Claudins家族。Claudins属于四分子交联体，为紧密连接蛋白，至少包括了24个家庭成员，位于腺上皮和内皮细胞膜靠腔面的一端，是相邻细胞膜之间最顶端的接触，对上皮细胞的屏障功能起着重要作用。它们编码4个跨膜区，N和C羧基末端均在细胞浆内。在正常上皮，紧密连接的主要功能是封闭腺上皮顶端的间隙，形成一个能阻止大分子物质通过细胞膜之间的间隙进入基底外侧区域的屏障。紧密连接是主导细胞粘附、细胞极性和腺体分化的关键因素之一。由于它可作为胞外环境到胞内信号通道的结合点，因此在细胞增生、肿瘤形成、细胞骨架等方面扮演了重要角色，越来越多的研究表明，这个家族许多成员对恶性肿瘤转移有着重要影响。Claudins家族中不同成员在不同器官癌症的作用并不是非常清楚。肿瘤细胞特别是那些高转移潜能的癌细胞通常表现为Claudins表达下降，但亦有报道某些Claudins成员在一些肿瘤中是增加的，如Claudin-1(CLD1)在大肠癌是增加的。 有报导CLD1可以促进癌细胞pro-MMP-2的活性，这表明它是癌细胞侵袭转移潜在因素。还有报导CLDl可能是β-catenin/Tcf信号通路的靶基因，这支持CLD1可能是调控结肠癌潜在基因。综上所述，我们推测CLD1参与了大肠癌细胞侵袭转移过程，是大肠癌细胞侵袭转移的潜在因素。 大肠癌的组织分期是一个重要预后指标，由于目前国际上尚无按组织分期对CLD1进行系统研究的报道，此范围的研究仍属空白，因此我们应用免疫组织化学方法检测大肠正常．腺瘤．癌(不同Dukes分期)组织中CLD1的表达，以利于明确其与大肠癌变病程的关系。 然后我们选取三株已证实具在不同转移潜能的大肠癌细胞株SW620，SW480和SW1116为研究对象，通过激光共聚焦显微镜、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(FQ RT-PCR)和Western Blot检测CLD1在这三株细胞的表达，随后进行CLD1基因转染和RNA干扰，对基因进行调控，观测调控前后大肠癌细胞在体外和动物体内侵袭转移生物学行为变化，初步探研CLD1影响大肠癌侵袭转移行为的机制。由于CLD1是膜蛋白，位于细胞表面，研究CLD1表达与调控将有助于阐明肿瘤细胞的侵袭转移机制，并可能为大肠癌的诊治带来新的研究靶点。 结论 1．免疫组织化学方法检测CLD1在大肠组织中的表达，CLD1主要位于肠上皮细胞，而在细胞外基质基本不表达。大部分正常粘膜与息肉局限在细胞膜表达，少有浆表达，且仅为弱阳性。腺瘤浆表达百分比增多、强度增加，大肠癌A期增强最显著。从腺瘤开始总阳性表达百分比显著增高，A期强阳性最多。说明CLD1表达改变可能提示早期大肠癌发生。 2．运用免疫细胞化学和激光共聚焦显微镜检测三株不同转移潜能的大肠癌细胞株Sw1116、SW480和SW620在CLD1表达部位，发现CLD1在细胞中的表达部位随着大肠癌的转移潜能增强由细胞膜转移至细胞浆和细胞核。FQ RT-PCR从mRNA水平、免疫蛋白印记从蛋白表达水平检测显示CLD1表达在SW1116，SW480，SW620细胞株之间存在差异，SW1116<SW480<SW620。 3．构建的CLD1真核表达载体可有效提高CLD1表达，CLD1提高后可减少SW480细胞之间的同质粘附，利于肿瘤细胞脱离原发灶向外侵袭；增加细胞与基质的粘附力；增加细胞的侵袭能力；增加细胞的迁移能力。 4．构建的CLD1发夹siRNA真核表达载体可有效抑制SW620 CLD1的表达量，在体外增加细胞之间粘附，抑制与基底膜的粘附，降低细胞的侵袭能力和迁移能力。动物实验说明降低CLD1表达可降低裸鼠成瘤能力，降低淋巴结转移和血行转移能力，说明CLD1正向调控大肠癌细胞的侵袭转移能力。 5．CLD1可能在大肠癌的发生、发展过程中起着重要的作用，有望成为大肠癌病人诊断和治疗新的靶点。