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摘要研究背景 目前，原位肝移植(OIrthotopic liver transplalltation，OLT)是治疗终末期肝病最有效和常规措施。然而，尽管由于外科技术的标准化、免疫抑制剂的不断研发和应用，移植物的长期存活率没有明显提高。器官移植术后的排斥反应仍是威胁患者和移植物长期存活的主要原因。免疫抑制剂的应用，虽然有效地抑制了急性排斥反应，但长期应用免疫抑制剂必然会给移植病人带来许多副作用和潜在的危险性，如增加感染、肿瘤的发生率，也不能有效地控制可导致移植物失功的慢性排斥反应的发生。因此，诱导受者对供者器官特异性免疫耐受是解决排斥反应最理想的措施，相对免疫抑制疗法，诱导免疫耐受的优势是从根本上避免了排斥反应，又不影响机体的正常抗感染和免疫监视功能，同时避免了药物毒性。而且，耐受的诱导对于最终克服异种移植免疫学障碍也许是最佳途径，因为异种移植免疫抑制需长期高水平的、非特异性的免疫抑制剂来维持。因此，诱导移植免疫耐受性，控制移植物排斥反应，保护移植器官的功能，这无论在同种移植和异种移植中都是十分重要的课题。 目前在啮齿类动物，已有许多可行的策略成功诱导出血管化移植物的长期存活。但应用这些策略过渡到临床，由于在大动物模型中得不到相同的结果，却受到了限制。国内外学者对诱导免疫耐受的尝试甚多，但结果均不甚理想，机制尚不明确，更没有成熟可应用于临床的方案。因此，如何成功地在成年大动物和临床诱导免疫耐受成为免疫学家和移植学家的主攻方向和目标。 细胞凋亡是机体内普遍存在的一种生理和病理现象。近来越来越多的研究表明凋亡细胞能够主动调节机体的免疫功能，并能通过调节机体细胞免疫和体液免疫的途径诱导免疫耐受。我们已成功的建立小动物移植模型并验证了供体凋亡细胞预处理受者能够诱导免疫耐受，并提出了一个新的观点：肝脏是特异性吞噬凋亡细胞的场所，凋亡细胞有局部免疫抑制的作用，吞噬了凋亡细胞的肝脏抗原递呈细胞在局部免疫抑制的环境下递呈抗原给T细胞，而诱导对被吞噬抗原的免疫耐受。现进行大动物实验来验证我们的发现，同时进一步探索凋亡细胞诱导免疫耐受的机制。 第一章非转流小型猪原位肝移植模型的建立 目的：探索建立简便稳定的小型猪原位肝移植模型，为我们大动物免疫耐受的实验提供平台。 方法：用非静脉转流的方法建立中国小型猪原位肝移植模型。实验过程分为供体手术、供肝修整、受体手术、围手术期处理四部分。供体采用基础麻醉，经腹主动脉取血备受体输血用，采用肝动脉及门静脉双灌注的方法进行供肝灌注。受体采用气管插管+静脉复合全麻，切除受体肝脏，先吻合肝上下腔静脉、门静脉后结束无肝期，然后依次吻合肝下下腔静脉、肝动脉，采用套管法吻合胆总管。 结果：共进行中国小型猪原位肝移植手术18例，平均手术时间(179.6±14.3)min，平均无肝期(27.3±3.4)min，术中平均失血量422ml，平均输血量444ml，本组无术中死亡，术后当天死亡1例，死亡原因为急性肺水肿，术后第二天死亡1例，死亡原因为胆总管吻合口胆瘘，术后7天存活率88.9％。术中无肝期门静脉及下腔静脉的阻断，导致血液动力学波动明显，代谢功能发生急剧变化：无肝期平均动脉压、中心静脉压与无肝期前比较有明显下降(P<0.01)；无肝期及新肝期出现酸中毒，PH值及碱剩余下降，手术结束时平均动脉压及中心静脉压恢复，经药物调整后血清钾下降，酸碱逐渐恢复正常。 结论：(1)移植肝脏修整时保留肝上下腔静脉周围的膈肌环，并行一周的锁边缝合，保证植入后吻合口无漏血，同时防止血管扭曲引起的回流不畅。(2)在猪肝移植胆道重建中采用套管法，可以简化手术操作，效果可靠，避免了胆瘘，同时明显缩短了手术时间。(3)熟练的手术技巧，并对血管吻合进行技术改进，可缩短无肝期手术时间，是非转流条件下猪原位肝移植成功的关键。(4)无肝期保持血液动力学的稳定是手术成功的重要保证，无肝期前开始扩容，无肝期补液速度加快，此时应用血管活性药物可较好的维持血液动力学稳定，静脉血流完全开放后，则严格限制液体输入，并根据血液动力学变化随时调整输液速度。(5)非转流条件下的小型猪原位肝移植模型具有手术方法简便、易于复制，标准化程度及手术成功率高，稳定性好的优点。 第二章 <'60>Coγ射线体外处理后的供者淋巴细胞预输注诱导猪肝移植免疫耐受的实验研究 目的：探讨通过<'60>Coγ射线体外处理后的供者淋巴细胞预输注诱导猪肝移植特异性免疫耐受可能性的方法，为不作常规免疫抑制处理成年大动物的诱导移植免疫耐受提供可行的途径。 方法：在已建立非转流小型猪原位肝移植模型的基础上，供体为中国四川版纳小型猪，受体为中国西藏小型猪，将供、受体组动物随机分为对照组与处理组进行移植手术。应用<'60>Coγ射线体外处理供猪淋巴细胞，AnnexinV/PI双标法检测<'60>Coγ射线处理后淋巴细胞的凋亡率。受猪术前7天经耳静脉输注供体<'60>Coγ射线处理过的淋巴细胞(5×10<'8>)，或不做预输注，观察两组受体猪移植术后的存活时间，术后检测肝功能、T淋巴细胞亚型及病理。 结果：(1)<'60>Coγ射线体外处理后的淋巴细胞凋亡率(48.70±6.17％)，较正常淋巴细胞凋亡率(0.14±0.09％)明显增高(P<0.01)。(2)实验结果显示处理组中位存活时间与对照组相同，中位生存时间为7天。(3)移植术后3天，处理组和对照组病理活检均呈急性中、重度排斥反应；术后6天，两组均呈急性重度排斥反应。(4)两组术后肝功能检测ALT、AST、TBil、TB及ALB测定结果均为肝细胞破坏表现。术后1、3、6天两组ALT、AST、TBiL均较术前增高(P<0.01)，TB、ALB较术前降低(P<0.01)，但两组间差异无显著意义(P>0.05)。(5)术后1、3、6天CD4<'+>T、CD8<'+>T、CD4<'+>CD25<'+>Tr升降趋势与血常规中LYM的升降趋势大致相同，两组间差异无显著意义(P>0.05)。 结论：<'60>Coγ射线体外照射可以诱导淋巴细胞凋亡。<'60>Coγ射线体外处理过的淋巴细胞预输注未能够诱导猪同种异体肝移植特异性免疫耐受。