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摘要日前治疗急性中耳炎仍以使用抗生素为主要手段，但由于新型抗生素研发的相对滞后及临床上常出现抗生素运用的不当，耐药现象较为普遍。因此目前急性中耳炎患者存在治疗周期长、效果差、费用偏高等问题，不少病人反复发作，易形成慢性中耳炎。根据急性中耳炎感染的流行病学研究资料，研制针对中耳炎病原菌的疫苗，接种于急性中耳炎的易感人群，以期有效预防中耳炎的发生，将有望解决这一困惑。肺炎球菌是国内外急性中耳炎发病的最主要致病菌。目前国内已研制出肺炎球菌结合疫苗，但其使用的蛋白载体为破伤风类毒素或白喉类毒素，在将来的临床运用中可能会面临与破伤风疫苗或白喉疫苗冲突等问题。肺炎球菌溶血素作为一种新型蛋白载体，具有各亚型肺炎球菌间交叉免疫保护作用等多方面的优势。本研究通过多糖蛋白偶联技术、基因工程技术等成功研制出用于预防急性中耳炎的肺炎球菌多糖和肺炎球菌溶血素结合疫苗，并通过幼龄小鼠的接种试验，证明有较好的免疫原性。 第一部分肺炎球菌荚膜多糖与蛋白质载体CEA结合疫苗的研制 目的：探索和建立肺炎球菌荚膜多糖与蛋白质载体结合疫苗的制备的适宜方法和条件，并通过幼龄小鼠的动物接种试验检测其免疫原性，同时为今后检测肺炎球菌多糖与溶血素结合疫苗的免疫原性制备包被抗原。 方法：用19F型肺炎球菌多糖(PS)以氨基还原法分别与鸡卵清蛋白(CEA)及牛血清白蛋白(BSA)偶联结合，以SepharoseCL-4B凝胶柱层析纯化。PS-CEA结合物加入氢氧化铝佐剂后制备成疫苗，PS-BSA结合物则用作本实验及以后研制肺炎球菌溶血素为载体的结合疫苗时ELISA法检测抗PS抗体时包被酶标板的包被抗原。分别以每次0.25μg、1.0μg、4.0μg 3种不同多糖含量的PS(19F)-CEA结合疫苗腹腔注射3周龄幼小鼠，每隔1周复种1次，接种第3次后7天采血。多糖疫苗对照组幼小鼠以19F型肺炎球菌多糖疫苗接种(每次4.0μg)，阴性对照组以0.15M PBs注射。用ELISA法检测小鼠血清中抗肺炎球菌多糖抗体水平。 结果：经SepharoseCL-4B凝胶柱层析洗脱后肺炎球菌多糖与蛋白CEA或BSA结合物的A<,200>峰值位置均较多糖及载体蛋白的各自峰值位置明显前移。以多糖含量分别为0.25μg、1.0μg、4.0μg的结合疫苗接种的 3 组幼小鼠血清中抗肺炎球菌多糖抗体IgG的几何平均滴度 (GMT) 分别为 18.05、28.85、36.09，多糖疫苗对照组为 7.70，阴性对照组为 5.69。多糖疫苗对照组抗体水平无明显增高(P>0.05)，3组结合疫苗实验组抗体水平均明显增高(P<0.001)。 结论：已成功建立制备肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的适宜方法和条件，该疫苗能在幼龄小鼠体内引起明显的免疫应答。 第二部分基因工程技术制备肺炎球菌溶血素 目的：制备肺炎球菌溶血素，为研制肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗提供新型的蛋白载体。 方法：根据 Walker 等 1987 年报道的肺炎球菌溶血素 (Ply) 基因序列(GenBank accession no．X52474)，设计一对带有两个限制性内切酶酶切位点的引物，运用PCR的方法，从肺炎球菌的染色体DNA中扩增出Ply的基因。对该PCR产物进行酶切、回收，再将其克隆入表达载体pET-28a质粒中，用此基因重组质粒转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主细胞，并以IPTG诱导蛋白质的表达。通过超声波破菌收集蛋白，对所得蛋白质用固相Ni-NTA树脂作亲和吸附纯化，再用SDS-PAGE电泳法鉴定表达的纯化基因重组Ply蛋白(rPly)。 结果：通过常规克隆方法和PCR技术成功克隆Ply基因，并经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析证实。成功构建了重组质粒并转化宿主细胞，蛋白表达的产物相对分子量为52KDa，经纯化后的rPly蛋白纯度达到90％以上。 结论：可通过基因工程技术克隆Ply基因并进行蛋白表达而获得肺炎球菌溶血素，采用固化镍树脂亲和纯化技术所得Ply蛋白的纯度可满足于用作蛋白质载体和酶标检测包被抗原的要求。 第三部分肺炎球菌荚膜多糖与肺炎球菌溶血素结合疫苗的制备及免疫原性研究 目的：研制肺炎球菌19F型荚膜多糖与肺炎球菌溶血素(蛋白)偶联结合疫苗，并检测其在幼龄动物体内的免疫原性。 方法：先用福尔马林将通过基因工程技术制备得到的肺炎球菌溶血素脱毒，去除其溶血活性，再用19F型肺炎球菌荚膜多糖(PS)以氨基还原法与之偶联结合，以SepharoseCL-4B凝胶柱层析纯化。将纯化后的结合物与铝佐剂混合制成疫苗。以该疫苗腹腔注射接种3周龄幼小鼠，剂量为3μg多糖含量/次，每周接种1次，接种1～3次。阴性对照组小鼠腹腔注射等量0.15M PBS。接种完成后用ELIA法检测小鼠血清中抗PS及抗Ply的IgG抗体水平。 结果：Ply 经福尔马林脱毒后失去溶血活性。19F PS-Ply 结合物经SepharoseCL-4B凝胶层析柱洗脱、纯化，其洗脱峰位置较19F PS与Ply二者的峰值位置均明显前移。用该结合疫苗免疫的幼龄小鼠接种1次、2次、3次时血清中抗PS(19F)抗体IgG的GMT分别为32.25、42.07、72.41，阴性对照纽为8.9(P值均<0.001)；抗 Ply 抗体IgG的GMT分别为 36.21、80.71、138.3，对照组为22.37(P<0.01或P<0.001)。接种1～3次时两种抗体效价均明显高于阴性对照组。 结论：用基因工程技术制备的肺炎球菌溶血素以福尔马林脱毒后作为蛋白载体与肺炎球菌荚膜多糖偶联结合，制成的结合疫苗能在幼龄小鼠体内诱导出明显的针对PS和Ply的免疫应答反应。