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摘要研究背景与目的： 慢性HBV感染的临床表型复杂多样，其形成机制尚未阐明。除了病毒因素外，宿主遗传易感性是一个重要的方面。宿主感染HBV后，HLA-Ⅱ类分子的表达水平直接影响宿主对HBV的免疫应答。CⅡTA是调控细胞表达HLA-Ⅱ类分子及水平的限速因子，其通过调控细胞是否表达HLAⅡ类分子及水平来决定宿主的免疫功能状态，从而影响感染性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥及肿瘤的发生、发展及转归。在HBV感染的遗传易感性研究中，疾病的关联研究最常用。国外研究发现CⅡTA基因存在SNP，并与自身免疫性疾病的易感性相关。我们前期研究发现中国人CⅡTA基因也存在SNPs，其中启动子Ⅳ区有4个，外显子区改变氨基酸序列的非同义SNPs有8个。我们选择编码区等位基因频率较高的2个非同义SNP位点C30799G(Ala500Gly)、C19170G(Leu45Val)在慢性HBV感染人群中进行基因分型，探讨CⅡTA编码区基因多态性是否与慢性HBV感染不同临床表型的形成有关，并对CⅡTA基因编码区不同单倍型进行初步功能研究。 研究对象与方法： 在627例不同临床表型的慢性HBV感染人群和101无HBV感染的正常健康献血员中，采用PCR-SSP技术对C Ⅱ TA编码区2个非同义SNP位点C30799G(Ala500Gly)、C19170G(Leu45Val)进行基因分型，分析每个位点的等位基因和每种基因型在慢性HBV感染不同临床表型人群中的分布频率。然后以野生型重组质粒EBS-NPL-CⅡTA(CC单倍型)为模板，采用重叠延伸PCR定点突变技术对CⅡTA基因编码区的这两个SNP位点进行突变，制备CⅡTA基因另外3种单倍型cDNA的部分片段，并构建了3种单倍型完整cDNA的真核表达载体。将4种单倍型的真核表达载体转染本身不表达HLA Ⅱ类分子的Hela细胞，用RT-PCR技术检测转染前后Hela细胞CⅡTAmRNA的表达，用间接细胞免疫荧光技术及流式细胞技术检测4种不同单倍型HLAⅡ类分子的表达。 主要研究结果： 1．30799位点C等位基因和CC基因型在原发性肝癌人群中的频率显著高于其在肝硬化人群中的频率(x<'2>=4.861，4.993；P=0.027，0.025)；经非条件logistic回归分析去除性别与年龄影响因素后的结果显示，30799位点各基因型频率在肝硬化与原发性肝癌两组人群间存在显著差异(OR 0.557;95％CI，0.334-0.930；P=0.025)，其两者间的显著差异主要存在于C基因隐性模式(CC比CG+GG)下(OR 0.491；95％CI，0.269-0.898：P=0.021)。 2．19170位点G等位基因和GG与GC基因型在肝硬化人群中的频率显著高于其在非进展性肝病(即无症状携带者+慢性乙型肝炎)人群中的频率(x<'2>=7.128,6.464；P=0.008，0.011)。经非条件logistic回归分析去除性别与年龄影响因素后的结果显示，19170位点各基因型频率在肝硬化与非进展性肝病两组人群间存在显著差异(OR0.742；95％CI，0.552-0.998；P=0.048)，其两者间的显著差异主要存在于G基因显性模式(CC比CG+GG)下(OR 0.581；95％CI，0.353-0.954；P=0.032)。 3．基于上述两个与慢性HBV感染相关的SNP位点，成功制备人CⅡ TA基因编码区3种单倍型(CG、GC、GG)cDNA的部分片段，并获得含有CⅡTA基因3种不同单倍型cDNA完整序列的真核表达载体。 4．未经转染的Hela细胞和转染空载体EBS-NPL的Hela细胞均无CⅡTAmRNA和HLA Ⅱ类分子(HLA-DR、DP、DQ)的表达。而转染4种不同单倍型真核表达载体的Hela细胞均出现CⅡTA mRNA表达，并表达3种HLAⅡ类分子。 5．转染4种不同单倍型真核表达载体后的Hela细胞彼此间HIA Ⅱ类分子(HLA-DR、DP、DQ)表达水平相差不显著(P均大于0.05)。 结论： 1．在慢性HBV感染者中，C30799G(Ala500Gly)位点多态性与肝癌的发生密切相关，CC基因型者发生肝癌的危险性显著增高： C19170G(Leu45Val)位点多态性与肝硬化的形成密切相关，携带G等位基因者发生肝硬化的危险性显著增高。 2．成功构建人CⅡTA基因3种不同单倍型的真核表达载体，为后续研究CⅡTA基因不同单倍型功能奠定基础。 3．证实CⅡTA是调控Hela细胞是否表达HLA Ⅱ类分子的关键因子，Hela细胞不表达HLA Ⅱ类分子与其缺乏C ⅡTA表达有关。 4．中国人C Ⅱ TA基因编码区C19170G(Leu45Val)与C30799G(Ala500Gly)两个位点的多态性(2个位点氨基酸的改变)不影响CⅡTA分子反式激活HLA Ⅱ类基因表达的能力。