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摘要目的： 1．从人包皮组织获得角朊细胞，将其进行体外无血清培养，探索其体外培养的生长特点。利于免疫磁珠细胞分选法(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)结合人胎盘Ⅳ型胶原粘附法从角朊细胞中分离出角朊干细胞后进行无血清培养，寻求一种理想有效的人角朊干细胞体外分离培养技术。 2．在本课题组前期已经成功构建两种人CCL20基因特异性小干扰RNA(smallinterference RNA，siRNA)重组慢病毒表达载体的基础上，补充测序鉴定出一种人CCL20基因特异性siRNA重组慢病毒阴性对照载体。同时，将构建的重组慢病毒载体以包装细胞293FT包装生产，最后以慢病毒颗粒感染人角朊细胞株HaCaT细胞和角朊干细胞，并初步检测siRNA对于角朊细胞表达CCL20的干扰效果。 方法 1．按照Dispase酶一胰酶两步消化法从人包皮组织获得角朊细胞(Keratinocyte，KC)，以人胎盘Ⅳ型胶原按照5μg/cm<'2>的密度包被培养瓶，将角朊细胞以无血清培养基(defined keratinocyte-serum free medium，DK-SFM)进行体外原代及传代培养，并观察其生长形态变化、克隆形成，并对原代培养的KC中的KSC以细胞表面分子CD49f(整合素α<，6>)、CD71(转铁蛋白受体)、CD29(整合素β<,1>)做表型检测。 2．以免疫磁珠法对KC细胞中的角朊干细胞(keratinocyte stem cells，KSC)进行分选，分析其分选的纯度和比例，再结合人胎盘Ⅳ型胶原粘附法将分选所得的细胞进行体外无血清培养，观察其生长情况及克隆形成。 3．将含有CCCL20-siRNA慢病毒载体重组质粒的大肠杆菌(escherichia coli，E．coli)的菌液以划线法接种于含有Amp 60μg/ml的LB平板上，筛选出阳性菌落、扩增后提取质粒，进行DNA测序鉴定。 4．重组慢病毒表达载体质粒pHSER-CCL20-siRNA-GFP-SIN、慢病毒包装质粒Lentipack和慢病毒包膜蛋白质粒Lentienv按照一定比例混合，与转染试剂jetPEI一同转染包装细胞293FT，24h后观察其荧光表达情况，并分别在48h、72h、96h后，收集含有慢病毒颗粒的培养基上清液，并保存在-80℃。 5．分别将慢病毒颗粒加入至培养至50-60％融合的HaCaT和人角朊干细胞，并设立空白对照组。24 h后，并在所有细胞中加入刺激因子TNF-α、IL-1β和DK-SFM的混合液，使TNF-α和IL-1β的终浓度均为100ng/ml。48h后收集细胞上清液，进行人CCL20的酶联免疫吸附测定(Enzyme linked-immuno-sorbent assay，ELISA)，在酶标仪上检测其OD<,450>值。根据试剂盒中标准品的浓度-OD<,450>值，求出其拟合曲线和方程，将样品OD<,450>值代入方程，得到样品中CCL20的蛋白浓度。比较几种慢病毒颗粒和对照组的CCL20浓度，初步评价siRNA干扰对于TNF-α和IL-1β共同刺激下的人角朊细胞株HaCaT和角朊干细胞表达CCL20的下调作用。 结果 1．角朊细胞以无血清培养基可在体外稳定培养35.13±7.59天，传3.87±0.83代，原代细胞克隆形成时间为5.75±0.90天。原代与传代细胞的克隆形成时间和传代时间差异不明显(P>0.05)，细胞经传代培养后细胞数无明显增加。 2．CD49f、CD71直接免疫荧光双重标记的原代培养角朊细胞中CD49f<'bri> CD71<'dim>细胞的比例为46.6±2.1％，CD29直接免疫荧光标记原代培养角朊细胞的阳性率为65.8±2.3％。 3．新鲜的人角朊细胞悬液经MACS法分选后所得的CD49f<'bri> CD71<'dim>细胞比率达(12.2±7.1)％。CD49f<'bri> CD71<'dim>细胞经培养可见细胞为典型的上皮样特征，呈铺路石样形态，高核浆比例，细胞紧密排列，轮廓清楚，折光性好，并可在5-7天左右可形成全克隆，符合角朊干细胞的特点。 4．构建的1种重组慢病毒阴性对照载体通过测序验证载体构建成功。 5．成功利用293FT细胞包装已经构建成功的重组载体质粒，生产出慢病毒颗粒，观察到其有较高的感染效应。慢病毒颗粒感染HaCaT和角朊干细胞后通过人CCL20酶联免疫吸附测定实验，初步观察到两种人CCL20基因特异性siRNA重组慢病毒表达载体对于人角朊细胞表达CCL20有一定的下调作用。 结论 1．对人KC的体外无血清培养方法进行了观察，探索出了其体外无血清培养的生长特性和规律。 2．将MACS分选法与人胎盘Ⅳ型胶原粘附法相结合从皮肤组织的表皮细胞悬液中直接分离出较高比例的干细胞，在如何对KSC进行大量纯化的方法学上做了一次新的探索，为后续研究提供了新的备选技术路线。 3．补充测序验证成功了1种人CCL20基因特异性siRNA重组慢病毒阴性对照载体。 4．以TNF-α和IL-1β共同刺激感染了CCL20-siRNA慢病毒颗粒的人角朊细胞株HaCaT和人角朊干细胞，并利用ELISA实验，测定两种细胞表达CCL20的变化情况，初步观察到siRNA对其表达CCL20的有一定的下调作用，从而为下一步筛选相应的阳性克隆和进一步评价其siRNA干扰效果奠定了基础。