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摘要研究背景及目的：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国女性恶性肿瘤中居第二位，且呈明显上升的趋势，尤其在一些沿海发达地区，如上海市，其发病率在2000年已跃居女性恶性肿瘤发病率之首。乳腺癌作为全身性疾病，其治疗绝非单一疗法所能奏效，除了手术、放疗等局部治疗手段，还需结合化疗、内分泌治疗、免疫治疗等全身综合治疗措施。尽管化疗的应用使得乳腺癌生存率显著提高，但其不可忽视的副反应，严重影响了患者的生存质量，越来越多的肿瘤耐药性的形成，大大降低了其疗效。因此，如何在保证患者生存质量的前提下尽可能地提高疗效，延长患者的生命，这样一个命题就不可避免地摆到医疗工作者的面前。干扰素(IFN)作为目前研究最多、唯一具有抗病毒和抗肿瘤双重作用的生物反应调节剂，越来越受到重视。IFN通过抑制肿瘤细胞的增殖，阻遏癌基因的表达，诱导肿瘤细胞的分化、调动机体免疫系统及抗肿瘤血管形成等方面杀伤肿瘤细胞，且IFN与化疗药物联合应用时能明显提高化疗药物的抗肿瘤活性。另有研究发现，IFN对肿瘤细胞表面的MDR-1表型有逆转作用。对有耐药肿瘤的病人在化疗前先使用IFN，可竞争性地结合P-糖蛋白，以克服多药耐药性。重组高效复合干扰素(以下简称rSIFN-CO)是通过比较22种天然人体包括α、β、ω等干扰素在内的多肽链氨基酸序列，并测定其活性单位结构，以相应位点之氨基酸出现频度及活性结构单位设计的一组全新氨基酸序列，然后再根据大肠杆菌密码子偏爱性设计出新的人工基因序列。它与临床上使用的重组复合干扰素-干复津的氨基酸序列是一致的(N-L-亚甲基-22-L-精氨酸-76-L-丙氨酸-78-L-天门冬氨酸-79-L-谷氨酸-86-L-酪氨酸-90-L-酪氨酸-156-L-天门冬酰胺-158-L-亮氨酸干扰素-α-1)，由于采用了全新的纯化工艺，使rSIFN-co的蛋白质空间构象发生了改变，令其具有更强的抗病毒作用及极低的副作用。目前关于此类复合干扰素应用于抗肿瘤的研究鲜有报道。本实验旨在探讨rSIFN-co抗乳腺癌细胞、逆转乳腺癌耐化疗药物细胞株耐药性的生物学活性，以及与抗肿瘤药物合用后的协同抗肿瘤作用。 方法： 1．采用MTT比色法和流式细胞仪技术，研究重组高效复合干扰素rSIFN-co、干复津、表柔比星对人乳腺癌MCF-7细胞及人乳腺癌阿霉素耐药株MCF-7/ADR细胞增殖、凋亡的影响，及rSIFN-co与化疗药物表柔比星合用后的协同抗肿瘤作用。 2．采用免疫组化SABC法检测经过rSIFN-co、干复津、表柔比星单用或联合处理的人乳腺癌MCF-7细胞及人乳腺癌阿霉素耐药株MCF-7/ADR细胞中P53、Bcl-2、CerbB-2、P-gp的表达水平。 结果： 1．细胞形态学观察结果：空白对照组细胞贴壁均匀，状态良好，各干预组贴壁细胞明显减少，培养液内细胞碎片增多，且随着药物剂量的增加和干预时间的延长更明显。 2.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色试验结果：对MCF-7细胞，各干预组OA值较空白对照组显著降低，其增殖抑制率与药物剂量、干预时间成正比，有统计学意义，且相同剂量的rSIFN-co较干复津对MCF-7细胞抑制率较高，差异有统计学意义。联合使用rSIFN-co+表柔比星及干复津+表柔比星，有一定的协同增强作用，差异有统计学意义。对.MCF-7/ADR细胞，相对较低浓度的表柔比星对MCF-7/ADR细胞抑制作用甚微：50μg/ml表柔比星作用48h后，其抑制率仍在20％左右。而最小剂量0.02μg/ml的rSIFN-co作用48h后，其抑制率达到了34％，且联合rSIFN-co+表柔比星(15μg/ml)有协同增强的抑制作用，联合使用72小时后协同作用更显著，5μg/ml rSIFN-co+15μg/ml表柔比星作用72h后抑制率达到了88.68％。干复津与rSIFN-co相比其抑制作用相对较弱，且与表柔比星的协同作用不显著。 3.流式细胞仪检测结果：与空白对照组相比，作用48h后，单用0.05μg/ml的表柔比星对MCF-7肿瘤细胞的凋亡无明显影响，单用15μg/ml表柔比星对MCF-7/ADR细胞凋亡亦无显著作用。单用5μg/ml的rSIFN-co、干复津或联合使用rSIFN-co+表柔比星、干复津+表柔比星后凋亡率较对照组显著增加，且rSIFN-co、干复津与表柔比星联用对凋亡均有协同增强的作用，但rSIFN-co+表柔比星优于干复津+表柔比星。 4.免疫组化结果：各药物处理MCF-7细胞48h后，rSIFN-co及rSIFN-co+表柔比星均能下调P53、CerbB-2蛋白及上调Bcl-2蛋白的表达水平，与空白对照组相比，差异有统计学意义。联合使用干复津+表柔比星可下调P53、CerbB-2蛋白及上调Bcl-2蛋白的表达水平，与空白对照组相比，差异有统计学意义，但单用干复津对CerbB-2表达无明显影响。rSIFN-co与干复津相比，rSIFN-co作用更强。各药物处理MCF-7/ADR细胞48h后，rSIFN-co组及rSIFN-co+表柔比星组均能下调P53、CerbB-2、P-gp蛋白及上调.Bcl-2蛋白的表达水平，与空白对照组相比，差异有统计学意义。干复津能下调P53、P-gp的表达及上调Bcl-2的表达，但对CerbB-2的表达水平无影响，联合使用干复津+表柔比星能下调P53、CerbB-2蛋白及上调Bcl-2蛋白的表达水平，但对P-gp表达的影响无统计学差异。除P53蛋白外，rSIFN-co对其余三种蛋白的表达变化均较干复津强，差异有统计学意义。 结论： 1.rSIFN-co和干复津均能抑制人乳腺癌MCF-7敏感株及阿霉素耐药株细胞的生长，而且有时间和剂量依赖性，相同剂量的rSIFN-co较干复津的抑制作用更强。 2.rSIFN-co和干复津抑制人乳腺癌MCF-7敏感株及阿霉素耐药株细胞的生长与促进癌细胞凋亡有关，相同剂量的rSlFN-co较干复津具有更强的诱导凋亡的作用。 3.rSIFN-co抑制人乳腺癌MCF-7敏感株及阿霉素耐药株细胞的生长与其降低增殖相关因子水平有关。 4.rSIFN-co和干复津增强表柔比星对人乳腺癌MCF-7耐药株细胞的生长抑制作用与其下调耐药蛋白P-gp的表达水平有关。