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摘要[前言]：本研究在试验中发现并经多次实验证明BM-cyclinl具有良好的多药耐药逆转活性。BM-Cyclinl是一种抗支原体的药物。BM-Cyclinl，大环内酯硫姆林(macrolide tiamulin)，它是短截北风菌素的其中一种半合成衍生物。它广泛使用于畜牧业、基础实验研究。它在基础实验研究的作用主要集中在克服细胞培养过程支原体污染。在实验中发现它具有良好的肿瘤细胞多药耐药逆转作用，且这种作用于其可以上调Topo Ⅱα蛋白和下调MRP2蛋白有关。 为验证BM-Cyclinl多药耐药逆转作用及探讨其机制，本实验着重研究了BM-Cyclinl体内外多药耐药逆转作用，并研究了其对Topo Ⅱα蛋白和MRP2蛋白的影响，以及对Topo Ⅱα转录调控的影响，旨在为其以后的临床应用提供理论基础。 [方法]： 1.BM-cyclinl对C-A120细胞多药耐药性逆转作用方法：取对数生长期的肿瘤细胞接种与96孔板，BM-cyclinl设1、5和10ug/ml的浓度组、不同浓度的ADM、VP-16和cisplatin以及相应的溶剂对照组。MTT法检测每孔OD值，Bliss法计算半数抑制浓度(ID<,50>值)。 2.BM-cyclinl对C-Al20细胞多药耐药性逆转机制的研究。 2.1.流式细胞仪检测细胞周期分布方法：使用0.1％血清处理各组细胞48小时，使各组细胞同步，BM-cyclinl(10μg/ml)处理C-Al20细胞96小时后。收集各组细胞，PBS洗涤两次，70％乙醇固定过夜。离心悬浮于PBS，细胞经溴化丙啶(PI)染色5分钟，流式细胞仪上检测细胞DNA含量，根据DNA含量在流式细胞仪中得出每份样品的Gl，S和G<,2>/M期细胞周期分布。LYSIS软件分析。 2.2.Western blot法检测Topo Ⅱa，MRP2蛋白表达情况方法：BM-cyclinl(10 ±g/ml)处理C-Al20细胞96小时后制备蛋白样品，定量。每泳道加等量的样品后开始聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规转印及封闭，分别标记一抗、二抗，暗室中曝光、冲片。 2.3.RT-PCR法检测Topo Ⅱα，MRP2 mRNA表达情况方法：BM-cyclinl(10 μg/ml)处理C-Al20细胞96小时后，按照文献报道使用Trizol提取各组细胞的总RNA，按照试剂盒操作说明书，进行RNA逆转录反应。将反应产物进行PCR反应。在1％胶，电泳，观察结果。 2.4.谷胱甘肽(GSH)表达情况的检测方法：BM-cyclinl(10 μg/ml)处理C-Al20细胞96小时后，用PBS洗涤细胞两次，离心(2000rpm，5min)收集细胞(其问进行细胞计数)。用三蒸水将各组细胞稀释至相同的浓度。将各组细胞至于-80℃迅速冷冻，并迅速取出至于室温溶解，重复三次。按试剂盒说明书进行检测。 2.5.k-DNA法检测BM-cyclinl对Topo Ⅱ酶活性的影响方法：按文献报道方法进行核Topo Ⅱ酶的提取。用反应Buffer将5μl核提取物与0.15gg的kDNA稀释成25μl，充分混合，置于37℃，15分钟，1/10体积的终止液终止。电压35V，4小时电泳。观察结果。 3.BM-cyclinl对C-Al20细胞TOPO Ⅱα转录调控影响的研究。 3.1.Western blot法检测Topo Ⅱα转录因子Spl、Sp3、NF-YA蛋白表达情况方法：BM-cyclinl(10μg/ml)处理C-Al20细胞96小时后制备蛋白样品，定量。每泳道加等量的样品后开始聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规转印及封闭，分别标记一抗、二抗，暗室中曝光、冲片。 3.2.报告基因法检测各BM-cyclinl对Topo Ⅱα各转录因子转录能力影响情况方法：根据Topo Ⅱα各启动子构建pGL3-GC1、pGL3-GC2、pGL3-ICB1、pGL3-ICB2、pGL3-ICB3质粒，与pRL-TK质粒，利用钙磷转染法共转染至各组细胞，根据Dual-luciferase Reporter Assay System试剂盒说明书，检测BM-cyclinl对Topo Ⅱα各转录因子转录能力影响情况。 4.BM-cyclinl对C-Al20细胞多药耐药性逆转的体内研究。 方法： 取对数生长期C-Al20细胞，生理盐水稀释成1×10<'6>细胞悬液，作腋下注射，成瘤保种。选择肿瘤生长旺盛且无溃破、健康情况良好的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，剥离肿瘤组织，再将其剪成直径为0.2cm左右的小块，接种至裸鼠腋下皮下。一周后根据肿瘤大小将其分组，设阴性对照组(蒸馏水)、BM-cyclinl组(5mg/kg)、ADM组(1mg/kg)、BM-cyclinl(5mg/kg)与ADM(1mg/kg)联合用药组。每天腹腔注射一次，连续10天。每2天用游标卡尺测量肿瘤大小及体重。按公式(Ⅰ)计算肿瘤体积，绘制生长曲线。处死小鼠，取其肿瘤组织，按公式计算(Ⅱ)肿瘤体积抑制率。按照金正均法，即公式(Ⅲ)计算药物问相互作用。 公式Ⅰ：肿瘤体积(V)=(π/6)(a+b)<'3>/8式中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。 公式Ⅱ：肿瘤抑制率(IR)=(C-T)/C×100％ 式中C为对照组肿瘤平均瘤重，T为各给药组肿瘤平均瘤重。 公式Ⅲ：q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)式中Ea+b为合用药物抑制率；Ea，Eb分别为单用药物抑制率q值在0.85-1.15：两药作用单纯相加q值>1.15：两药作用为协同q值<0.85：两药作用为拮抗。 [结论]： 1.BM-cyclinl能够明显逆转C-Al20细胞对ADM、VP-16和cisplatin三种化疗药物的耐药性，呈剂量依赖性。且BM-cyclinl本身细胞毒性很低。 2.BM-cyclinl能够明显上调耐药细胞C-Al20细胞的Topo Ⅱα的mRNA与蛋白的水平。同时还促使Topo Ⅱ酶活性明显上调。使Topo Ⅱα表达与活性上得以恢复，从而逆转MDR。 3.BM-cyclinl明显改善耐药细胞Topo Ⅱα的转录调控，表现在上调转录因子BM-cyclinl对C-Al20细胞多约耐药性逆转作用及其机理的研究NF-YA、Sp1的量，以及上调Sp1/Sp3的比值。 4.BM-cyclinl可减少C-Al20细胞的G1期细胞所占比率，G2/M期与S期细胞水平上调。 5.BM-cyclinl能够明显下调C-Al20细胞的MRP2的mRNA与蛋白的水平。 6.在荷瘤小鼠进行的抑瘤试验也证实BM-cyclinl能够有效逆转C-Al20细胞的多药耐药性。