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摘要百脉根又名牛角花、五叶草和鸟趾草，是豆科百脉根属多年生草本植物，原产于欧、亚温暖地带。适应性广，产量高，营养含量居豆科牧草首位，在成熟收获后，蛋白质含量仍可达17.4％，品质佳，适口性好，各类家畜均喜食。根系发达，改土肥田效果和保持水土性能好。全草亦可药用，也是很好的蜜源植物。欧洲、北美以及澳大利亚、新西兰、日本均有栽培。我国贵州、云南、湖北、湖南、陕西省均有野生种。华南、西南、西北、华北等地均有栽培，是我国温暖湿润地区极有希望的优良牧草。 兔出血症是由兔出血症病毒所致的一种急性、高度传染致死性疾病，以全身实质器官水肿、淤血及出血性变化为主要特征，其发病率和致死率都很高，是兔的一种毁灭性传染病。该病于1984年春在中国江苏无锡、江阴等县市首先暴发，其后世界各养兔地区都相继发生，给养兔业造成了巨大的经济损失。RHDV衣壳蛋白VP60与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关，是病毒免疫保护性抗原；另一方面，RHDV只有一个血清型，注射疫苗是预防RHD的最有效方法，但由于RHDV迄今未能稳定地适应于任何细胞培养，现行疫苗只能用感染RHDV致死的兔肝脾组织制备组织灭活疫苗，存在着诸多弊端。而用VP60制备RHD亚单位疫苗是一个新的途径。 本研究从植物再生体系的建立到表达载体的构建，再到遗传转化体系的建立，比较系统的研究了以百脉根作为植物生物反应器生产RHDV口服疫苗的相关成套技术，为利用转基因百脉根作为生物反应器生产兔出血症疫苗(包括其它各种疫苗)，特别是能口服的疫苗建立初步的技术基础。 对百脉根组织培养的研究，国内少有报道。本研究在前人工作的基础上采用正交试验方法，力求全面、准确的研究百脉根植株再生系统，以期增加可行性和提高再生效率。以MS为基本培养基，以下胚轴、子叶、茎、真叶为外植体，通过调整激素种类与浓度等培养条件，研究不同激素浓度组合对愈伤组织的诱导、分化及根再生的影响。结果表明，MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培养基可高效诱导愈伤组织的形成，以下胚轴为外植体诱导的愈伤组织呈深绿色，结构较紧密，生长势强，为再生性的愈伤组织，为最适合的诱导外植体，以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基诱导芽的分化，速度快而且单个外植体丛生芽的分化个数也要多于其它培养基，为最优的诱导芽分化培养基，MS +NAA 0.1 mg/L 培养基能快速诱导根的生成，形成再生植株。以植物表达载体 pBI121 为基本框架构建植物表达载体 VP60-pBI121。用 Xba Ⅰ和Sac Ⅰ分别双酶切载体 pGEM-T easy (克隆有VP60基因)和 pBI121，回收 pBI121 大片段和 VP60基因片段，过夜连接，转化、筛选得到阳性克隆，经 PCR、酶切和测序鉴定后，证明VP60基因已连接到pBI121载体上以已经建立起来的再生体系为基础，以农杆菌 LBA4404 (含质粒 VP60-pBI121) 为介导转化百脉根，来探索百脉根的高效遗传转化体系。结果表明，外植体预培养 3 d，在OD600 为 0.6 的菌夜中浸染 20 min，共培养3 d，以及 300 mg/L 羧苄青霉素脱菌浓度和50 mg/L 卡那霉素筛选浓度为最佳转化条件。以百脉根作为转基因植物疫苗生产的受体植物来研究它的遗传转化系统，目前尚未见有报道。