检索历史 清除

摘要干扰素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由活化的T细胞和NK细胞产生。IFN-γ对机体免疫系统具有强大的调节作用，是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分，因此，IFN-γ在疾病的诊断、治疗和疫苗免疫效果检测等方面起着重大作用，是现代分子生物学、免疫学和临床医学研究的热点之一。本研究依照猪IFN-γ(plFN-γ)基因序列，去除信号肽后设计引物，PCR扩增该基因并克隆至原核表达载体pET-30a，构建pET-30a-plFN-γ重组表达载体，经PCR、双酶切、测序鉴定正确后，转化入寄主菌BL21(DE3)，用IPTG进行重组plFN-γ诱导表达，并对该表达系统的表达条件进行优化，结果表明：重组plFN-γ得到正确的诱导表达，表达的最佳条件为在LB培养基中28℃诱导8h，诱导剂浓度为0.1mmol/L。此外还发现，无论在何种条件下进行诱导表达，包涵体形式的重组蛋白较可溶性形式的量多，降低诱导表达温度可使可溶性形式的重组蛋白量增加。可溶性的表达产物用镍亲和层析柱纯化，再用Sephadex-G100做进一步纯化；而包涵体产物经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化。纯化后的表达产物经SDS-PAGE、Western blot分析证实得到了高纯度的重组plFN-γ。对纯化的重组plFN-γ进行了一系列生物活性的研究：(1)用细胞病变抑制法对纯化的重组猪IFN-γ进行抗病毒活性测定，结果表明纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制活性，在PK15细胞系上其对伪狂犬病毒(PRV)的抑制活性为2.0x103U.mg-1，对标准O型口蹄疫病毒抑制活性为2.56x105 U.mg-1；(2)用纯化的重组猪IFN-γ对培养的传代细胞PKl5进行诱导，结果显示plFN-γ在高浓度时可诱导PK15细胞发生凋亡；(3)在体外以不同剂量的重组猪干扰素吖刺激PK15细胞和猪腹腔巨噬细胞，再用弓形虫进行攻击感染，结果随着猪干扰素γ的剂量的增大，巨噬细胞抗虫作用增强，而不同浓度的重组猪干扰素-γ对侵入PK15细胞内的弓形虫均无明显影响。本研究为猪IFN-γ相关的基因工程生物制品的开发奠定了基础。