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摘要本研究的目的是建立有效的昆明小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层培养体系，用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的研究，筛选出更适合于昆明小鼠ES细胞的克隆培养体系，为进一步建立昆明小鼠ES细胞系奠定基础。 1.分别选取妊娠11 d，14.5 d和16 d的孕鼠胎儿分离成纤维细胞，比较分离不同日龄胎儿的成纤维细胞增殖及纯化情况，以及观察不同接种密度，成纤维细胞体外培养生长状况。选择成纤维细胞分离培养的最适胚龄和最佳培养条件。试验结果显示，14.5 d的孕鼠胎儿分离培养成纤维细胞效果最好。可分离到大量的成纤维细胞，杂细胞少，并且细胞增殖快。生长旺盛、已纯化的第三代成纤维细胞最适宜做ES细胞的饲养层。 2.采用全胚培养法，比较桑椹胚和囊胚对ES细胞分离培养的影响。将桑椹胚和囊胚分别培养在饲养层上，桑椹胚的贴壁率、内细胞团(ICM)增殖率和ES细胞集落的出现率均显著低于囊胚(P<0.01)。由此看出，试验中获得的小鼠囊胚更适合作为ES细胞分离克隆的材料，并且妊娠第4天采集的胚胎囊胚率高。 3.比较三种不同浓度消化液：0.25％胰酶+0.04％EDTA，0.05％胰酶+0.04％EDTA和0.02％胰酶+0.01％EDTA，对内细胞团、ES细胞集落分离克隆的影响。试验结果显示，0.02％胰酶+0.01％EDTA是较好的ES细胞消化液，对细胞的损伤力小，且传代后ES细胞集落形成能力也较高；对没有消化离散的大的细胞团块，吸出后用机械法切割。 4.选取生长旺盛并且已纯化的第3代成纤维细胞，经丝裂霉素-C处理后，用细胞计数板计算细胞数，分别按密度为1×104个/mL，1×106个/mL和1×108个/mL接种，制备饲养层，观察不同密度饲养层的生长状况和不同密度饲养层上囊胚、内细胞团及胚胎干细胞的克隆生长情况。试验结果表明，囊胚在密度为1×106个/mL的饲养层上，贴壁率和内细胞团孵出率分别为(97.04±3.606)％，(96.3±2.887)％，显著高于其他两组；密度为1×106个/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104个/mL(差异极显著，P<0.01)和1×100个/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异显著(P<0.05)；而1×104个/mL饲养层和1×108个/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05)。因此，以1×106个/mL密度接种的成纤维细胞作为饲养层，最适合用于分离培养昆明小鼠ES细胞，有利于囊胚的发育、内细胞团的增殖、促进ES细胞的增殖，并起到抑制其分化的作用。 5.对分离克隆出的ES细胞进行细胞形态、集落形态、碱性磷酸酶测定、核型分析以及体外分化能力加以鉴定。分离得到的ES细胞有典型的形态学特征，集落呈鸟巢状，边缘清楚，表面平滑，结构致密，其隆起生长，细胞之间界限不清楚；碱性磷酸酶染色呈强阳性，ES细胞集落具有正常的二倍体核型，可形成拟胚体。表明培养扩增后的细胞具有ES细胞的典型特征。