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摘要Duchenne型肌营养不良症(Duchenne musculardystrophy，DMD)是一种以骨骼肌进行性变性、坏死为主要病理特征的致死性X-性连锁隐性遗传性肌病，发病率为男性活婴的1／3500。此病发生的主要原因是抗肌萎缩基因部分区域的缺失、重复或点突变，导致肌细胞膜上该基因编码的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的缺乏或结构变异，引起肌细胞膜的形态和功能损害，致使肌纤维变性坏死，肌卫星细胞耗竭。患者多于20岁左右由于呼吸衰竭或心力衰竭而死亡。 对于此病目前尚无有效的治疗方法，细胞移植被认为是治疗该病有希望的一种途径。 1998年，Ferrari等将骨髓干细胞从尾静脉注入scid／bg小鼠中，可检测到骨髓干细胞有肌源性细胞分化并参与肌肉的再生。在国家自然科学基金的资助下，我们研究小组将体外培养的异源性的问充质干细胞以及将mdx间充质干细胞基因修饰后移植到DMD模型鼠(mdx鼠和dko鼠)中，发现抗肌萎缩蛋白表达并且模型鼠的电生理、生化、运动功能和生命期限都有明显改善。在移植后12周仍可在受体鼠的骨骼肌膜上检测到抗肌萎缩蛋白的表达。 此外，由于肌管是分裂终末的多核细胞，以前的观点认为：一定剂量的光照射后，它仍可维持正常的功能。实际上，光照射后，特别是实验室常用的荧光显微镜的激发光照射后肌管的收缩能力是否有改变尚不清楚，阐明这个问题将为研究肌病的机制提供新思路。 本研究攻克分离培养小鼠间充质干细胞的难关。并将已构建的含microdys基因的逆转录病毒，对mdx鼠骨髓间充质干细胞进行基因修饰，与野生型的骨髓间充质干细胞对比，通过5-Aza、条件培养基及共培养诱导，观察小鼠间充质干细胞肌管的形成及microdys蛋白的表达对肌管形成的影响。然后，又对mdx鼠的成肌细胞进行基因修饰，进一步证实microdys蛋白影响肌管形成并用蛋白酶抑制剂-亮抑酶肽进一步分析microdys在肌管形成中可能的机制。同时探讨来源倒置荧光显微镜的激发光对肌管收缩能力的影响。 1.材料和方法 1.1实验动物间充质干细胞取自6-8周的Mdx和C57BL／10鼠，成肌细胞取自5-7天的mdx鼠和C57BL／10鼠。 1.2实验方法1.2.1 酶切法及测序鉴定逆转录病毒载体microdystrophin基因构建pLNCX2-microdystrophin逆转录病毒载体，提取质粒以HindⅢ进行酶切鉴定，筛选正确插入的重组质粒pLNCX2-microdystrophin。采用Sanger法进行测序并与原始序列进行比对。 1.2.2 Microdystrophin逆转录病毒载体的包装、病毒滴度测定经LipofectamineTM 2000转染pLNCX2-microdystrophin和pLNCX2到生长良好的PA317细胞中，G418筛选至阳性克隆形成，扩增阳性克隆细胞，收集上清，得到pLNCX2-microdystrophin病毒液(microdys病毒液)和pLNCX2病毒液。收集microdys病毒液，提取病毒颗粒，PCR检测病毒结构基因env的存在。并将microdys病毒液按不同梯度稀释并感染NIH3T3细胞，采用G418(400ug／ml)进行抗性筛选4周。经筛选的细胞逐渐形成克隆，统计细胞克隆数并计算病毒滴度。选择高滴度病毒液包装克隆进行扩大培养，行间充质干细胞和成肌细胞的感染实验。 1.2.3 小鼠间充质干细胞的分离培养、鉴定及比较分别取C57、mdx鼠的骨髓细胞，清洗，计数后，用L-DMEM培养液重悬，以2×106 cells／cm2密度种入六孔板中。一般3天左右换培养液，将未帖壁的细胞移去。一周后，异质性细胞群出现，这通常是骨髓基质细胞。一周内换两次液维持细胞生长以移去未帖壁的细胞。2到3周后，相对形态均一的细胞群出现。对分离的细胞行细胞表型及分化实验。 1.2.4 含microdystrophin逆转录病毒液和空载体逆转录病毒液感染小鼠间充质干细胞及目的克隆的筛选将细胞分为microdys病毒液(感染组)、pLNCX2病毒液(阴性对照组)和未感染组。选择滴度较高的microdys病毒液加入到mMSCs(mdx鼠)中，吸附4小时后更换培养基，细胞继续培养48小时后进行其短暂表达检测。以Trizol试剂盒提取感染后48小时的mMSC总RNA进行RT-PCR反应，上游引物为GCAAACTGT ATT CAC TCAA，下游引物为GTC TTT CAAGAT CCA CAG，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(若有microdystrophin的表达，则应出现309pb的DNA片段)。使用G418(200ug／ml)筛选细胞细胞至阳性克隆形成，扩增阳性克隆细胞，传代并检测其是否可以稳定表达microdystrophin。 1.2.5 C57BL／10间充质干细胞、mdx鼠间充质干细胞，转染空载体和microdystrophin的mdx间充质干细胞在不同条件下，成肌能力的比较. 1.2.6 亮抑酶肽(Leupeptin)对mdx间充质干细胞成肌分化的影响MdX间充质干细胞用5-Aza、条件培养基和共培养诱导成肌分化的同时，加入50umol／L亮抑酶肽，观察mdx间充质干细胞形成肌管的能力。 2 结果 2.1 Microdystrophin成功插入到逆转录病毒载体已构建好的pLNCX2-microdystrophin逆转录病毒载体，经HindⅢ酶切鉴定后证实为正向连接，采用Sanger法测序结果显示插入的microdystrophin基因方向正确，与原始序列进行比对比，基本吻合。 2.2重组病毒液滴度达实验要求利用质粒转染成功地将pLNCX2-microdystrophin和pLNCX2导入PA317包装细胞中，两组病毒液的病毒滴度为3×103-4×105。 2.3两种小鼠间充质干细胞的形态学、表面标志及分化能力的比较取骨髓细胞种板后，3天后换液；待细胞汇合度达70％-80％时，原代细胞用胰蛋白酶消化。细胞传代四次后，mMSCs呈现形态相对均一的细胞群。贴壁的细胞大部分呈梭形，少部分呈闪亮的园形，极少数为三角形或多角形。经流式细胞仪检测，C57BL／10-mMSCs表面标志CD11b阴性，CD34和Sca-1为阳性，而mdx-mMSCs则CD11b和CD34为阴性，Sca-1为阳性；两种来源的MSCs均能向成骨和成脂方向分化，但C57BL／10-mMSCs的成骨能力要强于mdx-mMSCs；在5-Aza的诱导下，C57BL／10-MSCs可分化成肌管，但未见mdx-MSCs形成肌管。 2.4含microdystrophin逆转录病毒液和空载体逆转录病毒液感染小鼠间充质干细胞及免疫荧光、RT-PCR检测感染后48h的小鼠间充质干细胞及阳性克隆的筛选感染组mMSCs中可见红色颗粒出现，深浅不一，而阴性对照组和未感染组mMSCs未见红色颗粒；感染组的RT-PCR产物经电泳后，可见309bp的DNA片段，说明microdystrophin基因成功转入mMSCs中并表达。用G418筛选出阳性克隆(约3-4周)，扩增阳性克隆细胞，传代并证实可以稳定表达。 2.5 C57BL／10间充质干细胞、mdx鼠间充质干细胞，转染空载体和microdystrophin的mdx间充质干细胞成肌能力的比较2.5.1 10um／L的5-Aza是不影响间充质干细胞增殖的最高浓度2.5.2 5-Aza诱导成肌分化后，肌管形成分析诱导3周后，mdx鼠间充质干细胞，转染空载体的间充质干细胞未见肌管的形在，但转染microdystrophin的mdx间充质干细胞13.3％(2／1.5)的培养孔中有肌管形成，C57BL／10间充质干细胞20％(9／45)的培养孔中有肌管形成。 2.6亮抑酶肽对mdx间充质干细胞肌管形成能力的分析Mdx间充质干细胞用5-Aza诱导后，在培养液中加入亮抑酶肽，3周后，发现20％(3／1.5)的培养孔中有肌管形成；条件培养基诱导发现66.7％(10／15)的培养孔中有肌管形成；共培养诱导发现66.7％(8／12)的培养孔中有肌管形成。 3 结论 3.1成功分离小鼠间充质干细胞并将之标准化，申请专利(2007100078985)。(创新点1)3.2 Microdystrophin是通过维持钙稳态，减少钙依赖性蛋白酶的活性而使mdx内源性干细胞形成肌管的能力增强。(创新点2)3.3在使用荧光显微镜时，与卤素灯的照射相比，汞灯来源的激发光可使肌管跳动的频率及强度增加，其原因可能是肌管吸收热能导致肌管中的收缩活动增强(创新点3)3.4 Microdystrophin的缺乏使mdx鼠中的内源性干细胞(间充质干细胞、成肌细胞)的肌管形成能力减弱；它除造成mdx鼠的卫星细胞易于凋亡，肌纤维坏死外，还能减少肌管的数量。 3.5间充质干细胞在不同的诱导条件下，共培养方式成肌诱导率最高，条件培养基的成肌诱导率次之，5-Aza能力较弱。