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摘要PRLs(phosphatases of regenerating liver)是一类蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosine phosphatase，PTP)，它们能够通过调节酪氨酸残基的磷酸化状态实现对蛋白质活性的调控，进而参与多种细胞生命活动。越来越多的研究结果提示PRL-3与肿瘤密切相关[1-5]。PRL-3在多种恶性肿瘤中均有不同程度的表达上调，尤其在转移灶中表达水平往往明显高于原发灶。这些研究结果都提示PRL-3可能有促进肿瘤转移的生物学作用，PRL-3可以作为肿瘤转移的分子标记物[3]。我们课题组研究了94例非小细胞肺癌和癌旁正常组织中PRL-3的表达情况，结果发现非小细胞肺癌中PRL-3表达阳性表达率为68％，PRL-3阳性表达与非小细胞肺癌的TNM分期、淋巴结转移呈正相关。但PRL-3调控肺癌侵袭转移的机制尚不清楚。我们通过siRNA干扰肺腺癌细胞系A549中PRL-3表达，观察肺癌细胞增殖、迁移侵袭能力的改变，检测RhoA活性及其下游蛋白mdiaphanous(mDia)的表达变化以深入揭示PRL-3影响肺癌细胞侵袭转移能力的作用机制。 材料与方法： 1、细胞株与试剂 HBE(Normal human bronchial epithelial cells)，人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株NCI-H661和NCI-H460、人肺鳞状细胞癌细胞系SK-MES-1。羊多克隆PRL-3抗体购自Santa Cruz公司，鼠单克隆mDial抗体购自BD生物科技公司；RT-PCR试剂盒购自Takara公司；Lipofectamine TM2000购自Invitrogen公司；PRL-3siRNA及乱序siRNA对照由Genzyme公司Beverly A Teicher惠赠(Xeragon/Qiagen；target sequence：TGAGAGCGGGATGAAGTACGA：siRNA Negative-1，Ambion)。 2、细胞培养 人永生化正常支气管上皮细胞系HBE常规培养于含15％胎牛血清、100U/mL青/链霉素的RPMI-1640培养液中；人肺腺癌细胞A549、NCL-H661、NCLPH460、SK-MES-1常规培养于含10％胎牛血清、100U/ml青/链霉素的DMEM培养液中，置37℃，5％CO2培养箱内培养。RhoA，mDia抑制试验A549细胞在含anti-RhoA抗体，anti-mDia1抗体100ng/mLDMEM培养液中培养24小时。 3、PRL-3 siRNA转染 收集指数生长期的A549细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×109个/L，接种细胞至24孔培养板上，按每孔接种5×104个细胞，并设复孔3个以校正实验误差．按Lipofectamin TM 2000操作说明书进行转染操作。 4、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 提取细胞总RNA,按RT-PCR(TaKaRa)试剂盒方法进行逆转录反应，反应体系为20μl，取2μl的RT产物进行PCR反应，反应体系为20μL。 5、细胞免疫荧光染色 将胰酶消化后的细胞均匀接种在24孔板上，4％多聚甲醛室温固定15min,正常山羊血清37℃封闭30min，滴加PRL-3一抗、二抗，或Phalloidin-TRITC(SIGMA)10μg/mL DAPI37℃孵育30min。 6、SDS-PAGE电泳和Western Blot 提取细胞总蛋白。电泳、转印，一抗、二抗，DAB显色。 7、生长曲线测定(MTT) 以103个细胞/孔的密度，将细胞接种于96孔细胞培养板内，置于细胞培养箱内培养，每过24h每组各取6孔细胞检测增殖情况。每孔内加入20μL MTT溶液，150μLDMSO，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。 8、细胞迁移和侵袭能力检测 细胞迁移能力检测，上室中加入100μL无血清DMEM培养基，细胞数为2.5×104个，下室加入600μL含10％胎牛血清DMEM培养基。37℃、5％CO2孵箱中培养6hr后吸尽培养基，固定，苏木素染色，镜下观察。细胞侵袭能力的测定用预冷的无血清培养基以1:7稀释Matrigel加入上室100μL，在室温下放置6h。其他与迁移实验相同，培养18hr后观察结果。 9、RhoA活性测定 实验按照G-LISATM RhoA Activation Assay Biochem Kit使用说明进行操作。酶标仪波长490nm检测吸光度。 10、统计学分析 应用SPSS13.0统计分析软件，两组样本采用t检验进行数据分析，两组以上样本采用方差分析，P<0.05为有统计学意义。 结果： 1、PRL-3 mRNA及蛋白在高转移能力的A549细胞和NCI-H661细胞中高表达，在永生化正常人支气管上皮细胞HBE中低表达。 2、PRL-3在高转移细胞系A549中的定位不同于永生化的正常人支气管上皮细胞系HBE。 3、PRL-3 siRNA有效地干扰了A549细胞中PRL-3 mRNA和蛋白的表达。 RT-PCR和western blot检测结果显示当转染PRL siRNA 48h后，A549细胞PRL-3的mRNA和蛋白表达水平开始下降，至72h时间点表达量达到最低。 4、特异性干扰PRL-3表达后A549细胞增殖能力未发生明显变化。 5、特异性干扰PRL-3表达后A549细胞迁移、侵袭能力均显著下降。 6、特异性干扰PRL-3表达后A549细胞RhoA活性显著下降；mDia蛋白表达水平明显下调。 7、封闭RhoA，A549细胞mDia蛋白表达明显降低，与正常A549细胞相比细胞内F-actin表达明显减弱，张力丝明显减少，细胞未见明显伪足形成；封闭mDia，与正常A549细胞相比细胞内F-actin表达明显减弱，张力丝明显减少。 结论： 1、PRL-3的表达与肺癌细胞系的迁移侵袭能力有关。 2、PRL-3通过调控RhoA活性及mDia表达调节细胞F-actin骨架的形成从而实现促进肺癌细胞迁移、侵袭的生物学功能。