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摘要本课题从C57BL/6J小鼠的胸腺组织通过RT-PCR法获得Iprl(intracellular pathogen resistance 1，细胞内病原体抗性基因1)基因全长编码序列，克隆入真核表达载体，体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，并在转录水平及翻译水平鉴定了Iprl基因的表达，并确定了Iprl基因表达产物的细胞内定位。观察了Iprl基因的表达对巨噬细胞生长状态的影响及巨噬细胞体外抗分枝杆菌H37Ra感染活性的影响。运用基因芯片技术检测Iprl基因的表达与巨噬细胞抗Mtb感染的免疫应答机制中的相关因素之间相互关系，初步探讨了Iprl基因在巨噬细胞抗Mtb感染中的作用机制。 第一部分 Iprl基因的获取及原核表达载体的构建和表达 目的：获取Iprl基因全长编码序列，构建Iprl基因原核表达载体，转化大肠杆菌，诱导重组蛋白表达，制备抗Iprl多克隆抗体。 方法：从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA，以RT-PCR法调取Iprl基因编码序列，上下游引入BamHⅠ、PstⅠ酶切位点，克隆至pMD19-T simple载体中获得重组质粒pMD19-T simple-Iprl，转化大肠杆菌JM109，筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复，测序正确后获得含正确Iprl序列的重组质粒﹡pMD19-T simple-Iprl。将Iprl基因亚克隆于原核表达载体pQE30，获得原核表达质粒pQE30-Iprl；以重组质粒﹡pMD19-T simple-Iprl为模板，PCR法扩增Iprl基因，上下游分别引入Kpn I、BamH I酶切位点，构建另一原核表达质粒pET32a(+)-Iprl。将pQE30-Iprl转化表达菌株SG13009、M15；pET32a(+)-Iprl转化表达菌株BL21、BL21(pLyS)，IPTG诱导目的基因的表达，SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况。 结果：从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变，经点突变修复后与GenBank报道的Iprl基因序列一致。亚克隆获得重组原核表达质粒pQE30-Iprl经酶切鉴定正确，构建的另一原核表达质粒pET32a(+)-Iprl经测序鉴定正确。pQE30-Iprl、pET32a(+)-Iprl分别在其相应表达菌株IPTG诱导表达，均未成功表达出Iprl重组蛋白。 结论：成功获取小鼠Iprl基因全长编码序列并成功构建含Iprl基因的两种原核表达质粒pQE30-Iprl、pET32a(+)-Iprl，但Iprl基因原核表达获取重组蛋白未获成功，提示Iprl基因原核表达可能有一定难度。 第二部分 目的：构建小鼠Iprl基因与EGFP基因融合表达载体，鉴定Iprl基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达及细胞内定位。 方法：限制性内切酶KpnⅠ、BαmHⅠ双酶切重组原核表达质粒pET32a(+)-Iprl及真核表达载体pEGFP-C1，获得的Iprl基因片段与pEGFP-C1载体大片段连接后获得真核表达质粒pEGFP-Iprl，经PCR、酶切鉴定正确后，脂质体瞬时转染pEGFP-Iprl至小鼠巨噬细胞株RAW264.7，以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照。采用RT-PCR法、Western blotting法分别在转录水平及翻译水平检测Iprl基因的表达及用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。 结果：成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-Iprl，瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，经RT-PCR、Western-blotting鉴定Iprl基因在转录水平及翻译水平获得表达，Iprl基因编码产物分子量大约50kD左右，荧光显微镜及共聚焦显微镜观察Iprl融合绿色荧光蛋白表达产物定位于细胞核内。 结论：成功构建了Iprl基因与EGFP基因融合表达质粒pEGFP-Iprl，成功转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，在转录及翻译水平检测到Iprl基因表达，Iprl基因表达产物定位于细胞核内。 第三部分 Iprl基因表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7生长的影响及杀伤分枝杆菌作用的研究 目的：观察Iprl基因表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的生长状态的影响，以及Iprl基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞体外杀伤结核分枝杆菌H37Ra作用的影响。 方法：1.采用脂质体瞬时转染的方法将Iprl基因真核表达质粒pEGFP-Iprl转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，同时转染空质粒pEGFP-C1作为对照组，应用MTT法检测Iprl基因的表达对巨噬细胞的生长是否有抑制作用；应用TUNEL原位凋亡检测Iprl基因表达对巨噬细胞是否有致凋亡作用。2.应用G418压力筛选稳定表达Iprl基因的小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，获得高表达Iprl基因的巨噬细胞(实验组细胞)，同时筛选空质粒pEGFP-C1转染稳定表达GFP的细胞(对照组细胞)。3.体外感染分枝杆菌H37Ra，感染后24h及96h细胞裂解物细菌培养菌落计数(CFU)的方法观察实验组细胞(Iprl+)、对照组细胞(Iprl-)抗结核分枝杆菌H37Ra感染活性。 结果：1.MTT法检测未发现Iprl基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7有抑制生长的作用；TUNEL原位凋亡检测结果末发现Iprl基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7有促凋亡的作用。2.经G418压力筛选后获得稳定表达Iprl基因的RAW264.细胞及空GFP表达的RAW264.细胞。3.细胞水平抗分枝杆菌H37Ra实验结果显示Iprl基因的表达的实验组巨噬细胞裂解物细菌培养菌落计数(CFU)低于对照组细胞，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 结论：Iprl基因的表达产物对巨噬细胞的增殖无抑制作用，也不引起巨噬细胞凋亡。G418压力筛选出高表达Iprl基因的细胞。体外抗菌实验表明Iprl基因的表达增强了巨噬细胞杀伤胞内吞噬的结核分枝杆菌H37Ra的能力。 第四部分基因芯片初步探讨Iprl基因的表达对巨噬细胞结核抗分枝杆菌感染免疫应答的影响 目的：应用小鼠固有免疫及适应性免疫应答功能分类cDNA芯片检测Iprl基因在巨噬细胞的表达对感染结核分枝杆菌H37Ra的巨噬细胞抗感染免疫应答相关机制的影响及相互关系。 方法：实验组(Iprl+)巨噬细胞RAW264.7与对照组(Iprl-)巨噬细胞RAW264.7分别感染结核分枝杆菌H37Ra，于感染96h后分别提取两组的总RNA，逆转录合成cDNA及线性生物素标记的cRNA，纯化cRNA后与小鼠固有免疫及适应性免疫应答功能分类基因芯片(113个基因位点)杂交，应用化学发光检测基因芯片杂交结果，采集图像经软件分析得到基因表达差异的结果。应用实时定量PCR法对芯片结果中上调的3个基因检测以验证芯片结果的可靠性。 结果：基因芯片结果经数据分析发现Iprl基因的表达上调了11个巨噬细胞抗Mtb固有免疫机制中的有关分子的基因转录，其中与巨噬细胞抗Mbt感染关系密切的基因有：参与TLRs信号通路的分子：TLR2、TLR4、Irak1、Traf6，以及干扰素相关基因：Ifngr1(IFN-γR1)和肿瘤坏死因子相关基因：Tnfrsfla(TNFR1)。而巨噬细胞参与调节适应性免疫应答相关的分子的基因表达如：IL-1、TNF-α、IL-12等表达无明显差异。对于3个表达下调的基因Clecsf12、Illrap、Ltf由于其标准值较低(＜0.05)，其准确度较低，可能意义不大。经定量PCR反应对TLR2、TLR4及Ifngr1的检测结果与芯片结果分析表明定量PCR结果与芯片结果趋势一致。 结论：通过对基因芯片结果的分析，我们初步推测，Iprl基因的表达可能主要是增强巨噬细胞抗Mtb感染固有免疫机制的有关基因的表达，特别是TLR2/TLR4及与其信号转导有关的分子以及IFN-γR1、TNFR1的表达，促进巨噬细胞的活化及杀伤胞内吞噬的Mtb，发挥抗菌作用。为下一步研究Iprl基因作用的分子机制及作用位点提供了重要的参考依据。