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摘要肝脏缺血再灌注损伤是肝脏移植中常见的问题之一,缺血再灌注引起的肝脏损伤是一个连续不断的过程,并最终导致肝细胞损伤。这个过程是在肝脏短暂缺氧并再氧合时触发,临床上许多情况下可发生肝脏缺血再灌注,例如肝脏低灌流状态,各种各样的外科手术操作,以及移植中的供体器官切取。实际上肝脏缺血再灌注损伤是抗原成分获取的结果,是影响肝脏移植结果的重要因素,引起10％左右的早期移植后器官功能衰竭,并且急性和慢性排异的发生率较高。此外,由于边缘性供体对于缺血再灌注损伤非常敏感,这加剧了供体器官的短缺。因此减少缺血再灌注损伤能明显增加获得手术成功的病人数量。然而,到目前为止仍没有可以预防缺血再灌注损伤的有效方法。所以,为了保护细胞和器官的功能,需要通过广泛的研究更好的了解肝脏缺血再灌注损伤的机制以及寻找合适的干预方法必要的。 青藤碱是从防己科防己属植物青风藤Sinomenium acutum Rehd.et Wils.根茎中分离出的主要活性成分,其结构类似于吗啡,分子式为C19H23NO4,分子量为329.38,具有镇痛,抗炎等作用,临床主要用于类风湿病的治疗,疗效确切。国内外的研究表明,青藤碱具有良好的抗炎、免疫抑制作用。但是在缺血再灌注损伤中的作用却未见报道。本课题应用“二袖套”法建立大鼠原位肝移植模型,研究青藤碱在肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用,并对其作用机制进行探讨。 第一部分：青藤碱对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用 目的：探讨青藤碱对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用。 方法：应用SD大鼠为模型动物；采用Kamada's“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只随机分为假手术组、生理盐水对照组、低剂量(40mg/kg)和高剂量青藤碱治疗组(80mg/kg),将供肝在4℃林格液中保存5h后植入受体,分别观察移植术后1周存活率,检测移植术后2,6,12,24h血清ALT、AST,TUNEL法检测肝细胞凋亡指数(AI),RT-PCR检测肝脏组织中的TNF-a、IL-1B、ICAM-1mRNA的含量,ELISA检测血清IL-2含量,并观察移植肝脏病理形态学的改变。 结果： 与对照组比较,青藤碱低剂量、高剂量治疗组术后1周存活率显著提高(75％,75％vs 12.5％,P<0.01),在各个时间点,青藤碱治疗组的ALT、AST水平明显低于生理盐水对照组(P<0.01),肝组织中的TNF-a、IL-1B、ICAM-1mRNA表达与对照组相比均显著减少(P<0.01),肝细胞凋亡指数下降,在肝移植术后24小时,生理盐水对照组的AI为37.0±4.30,而在青藤碱两治疗组分别为23.8±3.27、18.6±3.03,与对照组相比有显著差异(P<0.01)。血清IL-2含量降低,肝细胞和肝窦内皮细胞形态也明显改善。 结论：青藤碱可以通过抑制Kupffer细胞激活及释放TNF-a、IL-1B等炎症性细胞因子及ICAM-1等粘附分子,抑制肝细胞凋亡,减少细胞免疫相关IL-2的分泌,减轻肝细胞及肝窦内皮细胞的损伤,达到保护肝移植缺血再灌注损伤的效果。 第二部分：青藤碱对大鼠肝移植缺血再灌注后TLR4、MAPKs和NF-kB表达的影响 目的：通过观察不同剂量的青藤碱对大鼠肝移植术后TLR4、MAPKs和NF-κB的影响,探讨青藤碱保护大鼠肝移植缺血再灌注损伤的机制。 方法：应用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只随机分为假手术组、对照组、低剂量(40mg/kg)和高剂量青藤碱治疗组(80mg/kg),将供肝在4℃林格液中保存5h后植入受体,选择缺血再灌注后大鼠肝功能损伤最严重的术后6小时为观察点。采用Western Blot方法检测大鼠肝脏组织的TLR4、磷酸化JNK、ERK、p38 MAPK和NF-κB蛋白表达的变化情况。 结果：在假手术组TLR4呈低表达,生理盐水对照组TLR4呈高表达,青藤碱显著降低了肝组织TLR4的表达(P<0.01)。磷酸化JNK、ERK在各组的表达比较无明显差异。磷酸化p38 MAPK和NF-κB在假手术组呈低表达,在生理盐水对照组高表达,而青藤碱明显抑制了磷酸化p38 MAPK和NF-κB的表达(P<0.01)。 结论：青藤碱保护大鼠肝移植缺血再灌注损伤的机制与抑制TLR4介导的天然免疫反应有关,通过抑制p38MAPK信号通路和NF-κB通路,减少下游TNF-a、IL-1B和ICAM-1等炎症细胞因子的分泌。 第三部分：青藤碱对肝脏缺血再灌注后抗原提呈细胞的影响 目的：通过观察不同剂量的青藤碱对大鼠肝移植缺血再灌注后肝脏来源的DC成熟和功能的影响,深入了解青藤碱保护缺血再灌注损伤作用的机制。 方法：应用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠48只随机分为生理盐水对照组、低剂量(40mg/kg)和高剂量青藤碱治疗组(80mg/kg),将供肝在4℃林格液中保存2h后植入受体,术后第三天切取肝脏,分离纯化肝脏DC,观察青藤碱对其成熟和功能的影响。以荧光抗体标记和流式细胞仪对DC进行表型分析OX62和MEtC-Ⅱ、CD86等分子。EACS检测移植后肝脏DC对荧光标记的卵清蛋白(OVA-FITC)能力,分析青藤碱对肝脏DC内吞功能的影响。收集获取的DC,用RT-PCR方法测定其中具有免疫调节作用的细胞因子IL-12,IL-1,TNF-a mRNA的表达水平,Western Blot方法检测各组肝脏DC表达的TLR4。收集各处理组肝脏DC以3H-TdR掺入法进行DC刺激同种异基因T细胞增殖功能(MLR)的检测。 结果：FACS分析显示,青藤碱处理组DC呈现不成熟DC的表型,DC表面MHC-Ⅱ类分子和CD86等分子表达均显著下降,而对照组则表现为成熟DC表型,高表达MHC-Ⅱ类分子和CD86分子。内吞功能试验发现青藤碱处理组平均荧光强度较对照组的明显增强,表明了青藤碱对肝脏DC向成熟DC转化具有抑制作用。提示青藤碱可显著降低缺血再灌注后肝脏DC的抗原提呈功能。对照组肝脏DC表达IL-12,IL-1,TNF-a mRNA等水平明显增高,TLR4蛋白的表达明显升高,而青藤碱处理组可不同程度抑制这种效应(P<0.01)。DC刺激同种T细胞增殖功能(MLR)的检测发现青藤碱处理后肝脏DC的混合淋巴细胞反应明显减弱,提示青藤碱能明显抑制DC向T细胞提呈抗原的能力。 结论：青藤碱对大鼠缺血再灌注后肝脏DC的成熟和功能具有抑制作用,青藤碱对肝移植缺血再灌注损伤的保护作用可能通过期其抑制DC成熟和功能,抑制缺血再灌注后T细胞的免疫应答有关。