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摘要胰腺癌是一种恶性程度高,进展迅速,手术切除率低,预后极差的恶性肿瘤,5年生存率仅有5％。DNA甲基化是一种主要的表观遗传学修饰方式。随着研究的深入,人们越来越意识到DNA甲基化在哺乳动物发育及肿瘤发生发展过程中发挥重要作用,且在肿瘤的诊断和治疗方面均有广阔的应用前景。 基于上述研究现状,本课题利用甲基化特异性PCR等分子生物学技术,研究弹性蛋白酶3B(ELA3B)基因和神经元正五聚体蛋白2(NPTX2)基因在胰腺癌低表达的分子机制,初步探讨NPTX2基因的功能。 一、ELA3B基因甲基化状态及其在表达调控中的作用研究 目的：检测ELA3B基因在胰腺组织中的表达情况及其调控机制。 方法：应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测30例胰腺癌、20例慢性胰腺炎和10例正常胰腺组织中ELA3B mRNA的表达,利用DNA甲基化转移酶抑制剂(5-Aza-dC)处理SW1990、BxPC-3、CFPAC、PANC-1和PaTu8988 5株人胰腺癌细胞株,比较处理前后胰腺癌细胞株中 ELA3B基因的表达情况,以甲基化特异性PCR(MSP)检测该基因启动子区甲基化水平。 结果:ELA3B基因在胰腺癌、慢性胰腺炎和正常胰腺组织ELA3B mRNA的表达率依次为46.7％、85.0％和100％。ELA3B基因在PANC-1、BxPC-3、CFPAC-1、PaTu8988、SW1990 5株人胰腺癌细胞株中均无表达,5-Aza-dC处理后,BxPC-3、PaTu8988、SW1990和PANC-1 4株胰腺癌细胞株表达ELA3B,而CFPAC仍不表达。PANC-1中ELA3B基因部分甲基化,而其他4株胰腺癌细胞株则处于高甲基化状态。胰腺癌组织ELA3B基因启动子区甲基化指数(MI)显著高于慢性胰腺炎和正常胰腺组织(7.02±6.31、2.33±0.97和3.31±0.75,P<0.05),其中ELA3B mRNA表达阴性胰腺癌组织的MI显著高于ELA3B mRNA表达阳性组织(11.83±7.82对3.82±1.18,P<0.05)。 结论：本实验首次检测了ELA3B基因在胰腺癌和慢性胰腺炎组织中的甲基化状态,首次揭示ELA3B基因启动子区高甲基化是导致该基因在胰腺癌组织中低表达的原因之一。 二、NPTX2基因在正常胰腺组织和胰腺癌组织中的表达 目的：检测NPTX2基因在正常胰腺组织和胰腺癌组织中mRNA及蛋白表达。 方法：应用实时定量PCR方法检测25例人胰腺癌及相应癌旁正常胰腺组织中NPTX2 mRNA的表达,利用免疫组织化学的方法检测人胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织中NPTX2蛋白的表达部位及表达水平。 结果：实时定量PCR检测AsPC-1、BxPC-3、CFPAC、PANC-1和PaTu8988 5株胰腺癌细胞株中NPTX2 mRNA相对表达量(Relative quantity,RQ)依次为1.23±0.28、0.46±0.15、0.27±0.24、0.19±0.16和0.15±0.14(n=5),上述5株人胰腺癌细胞株中NPTX2基因的平均RQ为0.46±0.45。25例胰腺癌组织及其癌旁正常胰腺组织中NPTX2基因的RQ依次为0.96±0.91 vs.2.78±1.42(n=25/group),两组有显著差异(P<0.001)。免疫组织化学检测结果提示,NPTX2蛋白主要定位于神经元细胞质,呈棕黄色或棕褐色。在癌旁正常胰腺组织中胰岛呈中等至强阳性染色,胰腺导管未见染色；而胰腺癌组织中恶变的胰腺导管上皮细胞未见NPTX2的表达。 结论：与癌旁相应正常胰腺组织相比,NPTX2基因在人胰腺癌组织中处于低表达状态,免疫组织化学检测提示正常胰腺组织中胰岛可见阳性染色,而无论是正常胰腺组织中的胰腺导管还是胰腺癌中的胰腺导管未见阳性染色。 三、NPTX2基因启动子甲基化状态检测及其在该基因研究表达调控的作用 目的：检测NPTX2基因在胰腺癌中甲基化状态及其对该基因表达调控的作用。 方法：通过定量MSP检测NPTX2基因胰腺癌细胞株和胰腺组织中的甲基化状态,并测定在DNA甲基化转移酶抑制剂(5Aza-dC)和组蛋白去乙酰化抑制剂(TSA、VPA)处理前后该基因mRNA的表达情况及其启动子甲基化水平；通过细胞爬片检测在DNA甲基化转移酶抑制剂处理前后5株胰腺癌细胞株中NPTX2蛋白的表达水平。 结果:MSP结果显示NPTX2基因在25例人胰腺癌组织中有4例(16.0％,4/25)为完全甲基化,21例(84.0％,21/25)处于部分甲基化状态。应用DNA甲基化转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化抑制剂处理人胰腺癌细胞株,分别测定了NPTX2基因在处理前后mRNA表达水平和启动子甲基化状态的变化,结果该基因启动子的甲基化水平(MI)与其mRNA表达量(RQ)成反比。AsPC-1在处理前MI和RQ分别为120.23和1.23,5Aza-dC处理后MI和RQ分别为51.31和2.17,5Aza-dC和TSA同时处理后MI和RQ分别为42.54和3.16;BxPC-3在处理前MI和RQ分别为60.32和0.46,5Aza-dC处理后MI和RQ分别为2.09和7.44,5Aza-dC和TSA同时处理后MI和RQ分别为2.78和12.30;CFPAC在处理前MI和RQ分别为23.18和0.27,5Aza-dC处理后MI和RQ分别为1.05和0.97,5Aza-dC和TSA同时处理后MI和RQ分别为0.45和1.67;PANC-1在处理前MI和RQ分别为90.07和0.19,5Aza-dC处理后MI和RQ分别为2.11和6.39,5Aza-dC和TSA同时处理后MI和RQ分别为5.59和2.42;PaTu8988在处理前MI和RQ分别为54.49和0.15,5Aza-dC处理后MI和RQ分别为11.04和0.45,5Aza-dC和TSA同时处理后MI和RQ分别为8.86和0.37。细胞爬片结果与实时定量结果一致,5Aza-dC处理后5株胰腺癌细胞中NPTX2蛋白表达水平有不同程度的升高。 结论:NPTX2基因的启动子甲基化参与该基因的表达调控,该基因启动子高甲基化是导致其在胰腺癌中的低表达的重要原因。 四、NPTX2基因功能的初步研究 目的：探讨NPTX2基因在胰腺癌中的作用及其机制。 方法：分别建立了包含NPTX2基因全长cDNA的真核及原核表达载体pcDNA3.1(+)-NPTX2和pGEX4T-1-NPTX2;用真核表达载体转染胰腺癌细胞,以实时定量PCR方法检测转染效率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率；并将转染上清转移至另-株胰腺癌细胞中进行培养,并以流式细胞仪检测细胞凋亡率；诱导原核表达载体表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NPTX2重组蛋白；采用亲和层析的方法纯化目的蛋白,并将透析后的纯化蛋白冷冻干燥保存；以MTT和流式细胞检测的方法观察重组蛋白对胰腺癌细胞生长、凋亡的影响。 结果：成功建立了包含NPTX2基因全长cDNA的真核及原核表达载体。用pcDNA3.1(+)-NPTX2真核表达载体对PANC-1胰腺癌细胞转染48h后,空载体对照组(pcDNA3.1(+)组)和实验组(pcDNA3.1(+)-NPTX2组)以AnnexinV试剂盒检测的凋亡率(％)依次为1.23±0.39 vs.2.77±0.97(n=6,P=0.005)。将PANC-1细胞转染后的细胞上清转移至PaTu8988细胞中继续培养,实验组的凋亡率(％)为41.64±1.07(n=3),较对照组(19.01±1.15,n=3)和空白组(13.32±1.00,n=3)相比,有统计学差异(P<0.05)。成功表达出GST-NPTX2重组蛋白,并将纯化过的重组蛋白去内毒素后用于PANC-1细胞株的培养,MTT和Annexin V凋亡检测结果为GST-NPTX2在终浓度900ng/μl时,与GST对照组相比,细胞的生长和凋亡均无显著差异(P>0.05)。 结论:NPTX2基因在胰腺癌细胞中表现出促凋亡作用,推测为真核表达的可分泌蛋白发挥了促捌亡作用。但是原核表达的GST-NPTX2重组蛋白未见相应的促凋亡作用,提示真核转录后修饰或可触及的NPTX2蛋白的N末端对其功能发挥有重要影响。这为进一步研究NPTX2基因在胰腺中的作用及其确切的作用机制奠定了理论基础。通过上述研究,本课题得出以下结论： 1、ELA3B基因启动子区高甲基化是导致其在胰腺癌组织中低表达的原因之一； 2、NPTX2基因在人胰腺癌组织中处于低表达状态； 3、NPTX2基因的启动子高甲基化是导致其在胰腺癌中的低表达的重要原因； 4、成功构建了NPTX2基因的真核、原核表达载体； 5、NPTX2基因在胰腺癌细胞中表现出促凋亡作用,真核转录后修饰或可触及的NPTX2蛋白的N末端对其功能发挥有重要影响。