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摘要背景与目的： SELDI-TOF-MS技术目前己广泛用于多种疾病的早期诊断及指导治疗,如恶性肿瘤、老年病、感染性疾病、眼表疾病、心血管疾病和神经系统疾病。由SELDI-TOF-MS技术产生的高通量分析,能反映被检样本中蛋白质的全貌,进而同时找到多个蛋白标志物。其中在筛选肿瘤特异性蛋白质中的应用最为广泛,也显得最为重要。目前,SELDI-TOF-MS技术主要应用于肺癌[11]、前列腺癌[12]、卵巢癌[13]、肝癌[14]、膀胱癌[15]、胰腺癌[16]、乳腺癌[17]、结直肠癌[18]和喉癌等特异蛋白质图谱的分析,目的在于发现有意义的蛋白标志物应用于恶性肿瘤的早期诊断、预测治疗敏感性及判断预后。 本课题拟通过利用SELDI-TOF-MS技术,比较分析中、晚期肺腺癌标准含铂类方案化疗敏感/耐药患者血清蛋白质图谱的差异,筛选预测中、晚期肺腺癌化疗敏感/耐药性的相关蛋白标志物；通过比较分析存活时间低于中位生存期与存活时间高于中位生存期肺腺癌患者血清蛋白质图谱的差异,筛选判断中、晚期肺腺癌预后的相关蛋白标志物。 材料和方法： 1.病例和对照组选择 病例组43例为：2006年3月至2008年3月,就诊于广州医学院附属肿瘤医院的肺癌患者,入组条件1.病理诊断为肺腺癌(按WHO/IASLC肺癌组织学分类,第3版,1999)。2.按美国肿瘤联合会(AJCC)2003非小细胞肺癌的分期法,属Ⅲ-Ⅳ期的不能手术的患者。3.PS评分≤2分,或KPS评分98≥分。4.首次诊断为肺腺癌,且未经过治疗。5.无严重心肺功能不全,肝肾功能大致正常。6.无活动性疾病或影响血清蛋白质含量的其他疾病(如肝癌等) 7.43例患者行标准含铂类方案化疗2周期后按RECIST评价方法,分为化疗有效组(CR+PR)和化疗无效组(SD+PD)。8.随访化疗后肺腺癌患者,现死亡22例,生存时间2个月至17个月不等,中位生存期为9个月。按照生存时间低于中位生存期与生存时间高于中位生存期将22例肺腺癌患者分为两组,每组各11例。见附表：表(1),表(2),表(3),表(4),表(5)。 2.血清样品处理和保存 用干燥试管抽取清晨空腹静脉血3～5ml,置于保新冰箱1～3小时,再用控温离心机,4℃ 1500转/分,离心10分钟,提取血清,分装成100 ul 一份,置于-80℃冰箱保存。 3.SELDI-TOF-MS检测 将样本加到芯片上以后,经过一段时间的结合反应,各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白芯片上,然后用缓冲液或水洗去不结合的非特异分子,就可获得保留的高分辨率的蛋白质,再加上能量吸收分子溶液,当溶液干燥后,就可以把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析。在芯片阅读器中以一定强度的激光打击,结合在芯片上的蛋白质发生电离和解吸附,不同质量的带电离子在通过电场时被加速,由于这些离子的质量电荷比不同,它们在真空场中飞行的时间长短不一致,记录仪通过检测飞行时间的长短,得出质量电荷比,信号由高速的模拟数字转化器转化记录并输入电脑,被测定的蛋白质以一系列峰的形式出现,绘制成质谱图,直接显示样本中各种蛋白质的分子量、丰度等信息。 4.参数设置 以All-in-one标准蛋白质芯片作为外参照。 激光强度200或190 灵敏度9 5.统计学分析 (1)用Protein Chip Software 3.1和Biomarker Wizard(BMW)软件,根据方差分析原理计算中、晚期肺腺癌患者化疗敏感组与耐药组间相同质荷比的蛋白质峰值表达差异的P值；及存活时间低于中位生存期肺腺癌患者组与存活时间高于中位生存期患者组间相同质荷比的蛋白质峰值表达差异的P值。根据P值的大小可比较每 -个质荷比峰在两样本中表达差异的显著性程度,P值越小说明该质荷比峰对区分两类样木越有意义。 (2)化疗敏感组/耐药组波峰强度之间的比较采用t检验,P<0.05为差别有统计学意义。 (3)存活时间低于中位生存期肺腺癌患者组与存活时间高于中位生存期患者组波峰强度之间的比较采用t检验,P<0.05为差别有统计学意义。 (4)根据分类决策树原理,用数据挖掘软件Biomarker Patterns Software(BPS)对数据分组和相关性进行线性分析,建立诊断模型。 结果： 1.实验重复性分析利用CIPHERGEN公司提供的All-in-one标准蛋白质芯片,我们成功对SELDI-TOF-MS产生的蛋白质图谱进行了重复性测试。结果显示,本实验所用的不同批次WCX2蛋白芯片、不同芯片点间的蛋白峰值有一定的重复性。 2.中、晚期肺腺癌标准含铂类方案化疗敏感/耐药血清蛋白标志物的筛选中、晚期肺腺癌标准含铂类方案化疗敏感/耐药患者差异表达的血清蛋白质谱：本实验中、晚期肺腺癌标准含铂类方案化疗敏感/耐药患者血清蛋白表达存在7个差异蛋白,m/z值分别为：16083.50Da,7963.17Da,16121.50Da,15921.60Da,8066.79Da,8040.17Da和3394.57Da。 预测模型的建立：利用Biomarker patterns software(决策树方法)对数据分组及相关性进行线性分析,建立预测模型。联合m/z为7963.17Da与16083.50Da的蛋白建立的模型可预测肺腺癌标准含铂类方案化疗敏感/耐药性,其敏感性86.36％和特异性80.95％。 3.判断肺腺癌患者预后血清蛋白标志物的筛选存活时间低于中位生存期肺腺癌患者组与存活时间高于中位生存期患者组血清蛋白质谱：没有筛选出差异蛋白。未能建立判断模型。 结论： 癌症是一种多基因、多步骤突变的复杂疾病,包含了多个基因突变的分子事件过程,如抑癌基因的功能丧失、癌基因的活化等。蛋白组学能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质,提供了一组蛋白质的功能及其模式的信息,能够同时反映细胞内部的遗传特性和外界因素的影响结果。SELDI-TOF-MS技术是一种新的蛋白组学方法,能够同时检测标木中大量的蛋白质,为整体的检测提供了可能。本实验应用该技术筛选出7个预测化疗敏感性蛋白标志物,推测该蛋白标志物的生物学来源有以下几种可能：(1)癌基因的活化产物或抑癌基因的功能丧失的结果；(2)异常肿瘤抗原刺激机体免疫而产生的抗体；(3)肿瘤衍生的与肿瘤发生发展密切相关的蛋白标记分子；(4)肿瘤状态下人体免疫系统产生的非特异性炎性反应蛋白质分子。