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摘要目的： 一、观察大鼠远端肺静脉中膜平滑肌组织上六次跨膜的非选择性阳离子通道瞬时受体电位通道(TRPCs)基因表达。 二、研究慢性低氧对大鼠远端肺静脉中膜瞬时受体电位通道基因表达的影响,以及环磷酸鸟昔苷(cGMP)特异的5型磷酸二酯酶(PDES)的选择性抑制剂西地那非对低氧所致大鼠远端肺静脉中膜瞬时受体电位通道表达改变的干预作用,为临床使用西地那非治疗肺动脉高压提供实验依据。 三、摸索大鼠远端肺静脉中膜平滑肌细胞的体外培养方法,为深入研究肺静脉在低氧性肺血管病变中的可能作用打下基础。 方法： 一、观察大鼠远端肺静脉平滑肌组织瞬时受体电位通道(TRPCs)基因表达：利用显微镜分离健康SD大鼠远端肺静脉中膜平滑肌组织,提取总RNA,进一步逆转录成cDNA,建立稳定的实时荧光定量PCR方法确定大鼠远端肺静脉平滑肌组织瞬时受体电位通道mRNA的表达,并对其进行相对定量分析。 二、西地那非对低氧性肺动脉高压大鼠远端肺静脉中膜平滑肌组织瞬时受体电位通道基因的影响：健康SD大鼠28只,随机分成四组,即正常对照组、单纯低氧组、单纯西地那非处理组、低氧并西地那非处理组,每组7只。将单纯低氧组和低氧并西地那非处理两组动物置入常压低氧舱内,向箱内注入氮气,降低舱内氧气体浓度。用测氧仪检测舱内氧气浓度,使之稳定于10％±0.5％。每天24小时持续低氧,连续3周。西地那非干预组大鼠饮用含西地那非(2.5mg/kg。天)的蒸馏水,非低氧对照大鼠置于同一房间只有呼吸室内空气,其它所有饲养条件在各组动物等同。持续3周后,麻醉处死大鼠,显微镜下分离远端肺静脉中膜平滑肌层,取左侧肺组织及心脏,称取右心室(RV)及左心室+室间隔(LV+S)重量,计算RV/(LV+S)t比值。肺组织分别行HE染色观察肺组织病理学改变,计算肺小静脉管壁厚度占管腔外径的百分比,免疫组织化学方法检测远端肺静脉平滑肌层瞬时受体电位通道蛋白表达情况。 三、大鼠远端肺静脉中膜平滑肌细胞的分离和原代培养：用显微镜分离大鼠远端肺静脉中膜平滑肌组织,采用酶消化法和组织块贴壁法进行原代培养,并运用免疫荧光法和透视电镜进行鉴定。 结果： 一、正常大鼠远端肺静脉中膜平滑肌组织有TRPCs基因表达,其表达强度分别为:TRPC1>TRPC6>TRPC3>TRPC4>TRPC7。 二、单纯低氧组大鼠远端肺静脉中膜平滑肌组织TRPC6表达较正常对照组明显升高,TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC7表达水平在两组之间未见明显差别。 三、低氧并西地那非组大鼠远端肺静脉中膜平滑肌层TRPC6表达较单纯低氧组显著降低(P<0.05)。其RV/(LV+S)、肺小动脉管壁厚度与血管外径比值也明显低于单纯低氧组(P<0.05)。 四、以酶消化法和组织块贴壁法成功培养大鼠远端肺静脉平滑肌层,为20％和30％。电镜下见到少量平滑肌细胞特征的肌丝。 结论： 一、大鼠远端肺静脉中膜平滑肌层有瞬时受体电位通道TRPC1、TRPC3、TRPC4、TRPC6、TRPC7表达。 二、低氧可以上调大鼠远端肺静脉中膜平滑肌层TRPC6的表达。 三、西地那非可以抑制低氧所致的大鼠远端肺静脉中膜平滑肌层TRPC6的表达,减轻低氧所致的大鼠肺动脉和右心室结构的重构。