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摘要目的: 1. 研究雷公藤多苷对雌性幼鼠生殖功能的损伤效应。 2. 研究补肾方药对雷公藤多苷所致雌性幼鼠生殖功能损伤的保护机制。 方法: 第一部分 雷公藤多苷对雌性幼鼠的生殖损伤效应及可逆性观察 采用4周龄SD雌鼠,根据体重随机分5组,分别是空白对照组(羧甲基纤维素钠)、阳性对照组(环磷酰胺CTX,12mg/kg·d)、雷公藤多苷高剂量组(GTW12mg/kg·d)、雷公藤多苷中剂量组(GTW9mg/kg·d)、雷公藤多苷低剂量组(GTW6mg/kg·d)。连续灌胃给药4周。分别在用药4周末,停药4周末、8周末、12周末处死动物,通过观察动情周期、脏/体比值、血清雌二醇含量和卵巢、子宫的组织病理来研究不同剂量的雷公藤多苷对雌性幼鼠的生殖损伤效应,以及该损伤是否存在可逆性。 第二部分 补肾方药对雷公藤多苷所致雌性幼鼠生殖功能损伤的保护机制 采用4周龄SD雌鼠,根据体重随机分5组,分别是空白对照组(羧甲基纤维素钠)、雷公藤多苷组(GTW9mg/kg·d)、雷公藤多苷加六味地黄组、雷公藤多苷加菟丝子、黄精颗粒剂组、雷公藤多苷加菟丝子黄酮组。连续灌胃给药12周,处死动物,检测指标。 1. 通过观察卵巢、子宫的脏体比值和组织病理,研究补肾方药促进雷公藤多苷所致雌性生殖损伤修复的组织形态学依据。 2. 用放射免疫方法检测血清性激素含量,用免疫组化方法检测卵巢、子宫组织中ER的表达量,研究补肾方药促进雷公滕多苷所致雌鼠生殖功能损伤修复的内分泌依据。 3. 用免疫组化方法检测卵巢组织中Bcl-2的表达量,研究补肾方药促进雷公藤多苷致雌性幼鼠生殖功能损伤修复的凋亡调控机制。 4. 用原位杂交方法检测卵巢组织中smad4mRNA与GDF-9 mRNA的表达量,研究补肾药促进雷公藤多苷致雌性幼鼠生殖功能损伤修复的分子生物学依据。 第三部分 补肾方药对雷公藤多苷所致生殖损伤雌鼠生育力的影响 采用4周龄SD雌鼠,根据体重随机分5组,分别是空白对照组(羧甲基纤维素钠)、雷公藤多苷组(GTW9mg/kg·d)、雷公藤多苷加六味地黄组、雷公藤多苷加菟丝子黄精颗粒剂组、雷公藤多苷加菟丝子黄酮组。连续灌胃给药12周,停药,用健康成年雄性SD大鼠按雌雄比1:1比例与实验雌鼠合笼2周,继续饲养至产仔后1周处死。通过计算受孕率、产仔数、活产率来研究在性成熟期前用雷公藤多苷对实验雌鼠成年后的交配、受孕、妊娠、分娩过程的影响。 结果: 第一部分 雷公藤多苷对雌性幼鼠的生殖损伤效应及可逆性观察 阳性对照组(环磷酰胺)实验鼠全部死亡,实验过程中出现明显的体重轻,体表温度低、尿血,泄泻,毛色枯,活动减少等表现。 各用药组与空白组比较,动情周期、脏体比值的组间差异在用药4周时均没有统计学意义(P>0.05);停药4周时GTW高剂量组(12mg/kg·d)雌鼠的动情周期延长,差异有统计学意义(P<0.01),脏体比值的组间差异没有统计学意义(P>0.05);停药8周时,高、中剂量组的脏体比值与空白组比较,组间差异有统计学意义(P<0.05),低剂量组与空白组比较组间差异没有统计学意义(P>0.05);动情周期的组间差异没有统计学意义(P>0.05)。停药12周时各组动情周期、脏体比值的组间差异比较均没有统计学意义(P>0.05)。体重与血清雌激素含量,各组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。 第二部分 补肾方药对雷公藤多苷致雌性幼鼠生殖损伤的保护机制。 1. 补肾方药对雷公藤多苷所致生殖损伤雌鼠卵巢子宫的脏体比值和组织病理的影响 雷公藤多苷9mg/kg·d连续用药12周后,实验雌鼠体重、脏体比值比较,各组间差异没有统计学意义(P>0.05)。雷公藤多苷组各项指标均值较低。次级卵泡数结果:GTW组与空白组比较,组间差异有统计学意义(P<0.05),其他治疗组与空白组间差异没有统计学意义(P>0.05);GTW组与GTW加菟丝子黄酮组间差异(P<0.01),GTW组与空白组和另外两个治疗组间差异(P<0.05)。三个补肾方药治疗组组间差异没有统计学意义(P>0.05)。子宫内膜厚度结果：空白组与GTW组间差异有统计学意义(P<0.05),与其他治疗组间差异没有统计学意义(P>0.05)。GTW组与GTW加菟丝子、黄精颗粒组间差异(P<0.01),与空白组和另外两个治疗组间差异(P<0.05)。三个补肾方药治疗组组间差异没有统计学意义(P>0.05)。黄体数与子宫腺体直径结果：各组比较组间差异没有统计学意义(P>0.05)。 2. 补肾方药对雷公藤多苷所致生殖损伤雌鼠血清性激素含量与卵巢子宫的雌激素受体(ER)表达的影响 雷公藤多苷9mg/kg·d连续用药12周后,血清雌二醇含量：空白组与GTW组间差异有统计学意义(P＜0.05),与其他各组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。各组与GTW组比较,差异均有统计学意义。GTW组与空白组、GTW加六味地黄组、GTW加菟丝子黄酮组比较组间差异(P＜0.05),与GTW加菟丝子黄精颗粒组比较组间差异(P＜0.01)。三个补肾方药治疗组组间比较,GTW加六味地黄与GTW加菟丝子黄精颗粒组、GTW加菟丝子黄酮组间差异有统计学意义(P＜0.05),GTW加菟丝子黄精颗粒组与GTW加菟丝子黄酮组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。血清卵泡刺激素：各组比较组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。血清促黄体生成素：空白组与GTW组及GTW加菟丝子黄精颗粒组比较,组问差异有统计学意义(P＜0.05),与其他治疗组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。各组与GTW组比较差异均有统计学意义。GTW组与空白组差异比较(P＜0.05),与三个补肾中药治疗组差异比较(P＜0.01)。三个补肾方药治疗组组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。ER表达受到GTW抑制。三个补肾方药治疗组组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。 3. 补肾方药对雷公藤多苷所致生殖损伤雌鼠卵巢组织bcl-2表达的影响 雷公藤多苷9mg/kg·d连续用药12周可以抑制实验雌鼠卵巢组织凋亡因子bcl-2表达。空白组与GTW组组间差异有统计学意义(P＜0.01),与其他治疗组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。GTW组除与GTW加六味地黄丸组间差异没有统计学意义(P＞0.05),与其他组间差异均有统计学意义,与空白对照组间差异(P＜0.01),与余两组间差异(P＜0.05)。三个补肾方药治疗组组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。 4. 补肾方药对雷公藤多苷所致生殖损伤雌鼠卵巢组织smad4 mRNA与GDF-9 mRNA表达的影响 雷公藤多苷9mg/kg·d连续用药12周可以抑制实验雌鼠卵巢组织中smad4mRNA、GDF-9mRNA表达。空白组与GTW组组间差异有统计学意义(P＜0.01),与其他治疗组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。各组与GTW组比较差异均有统计学意义,其中GTW组smad4mRNA表达与空白组间差异(P<0.01),与其他组间差异(P<0.05);GTW组GDF-9 mRNA表达与GTW加菟丝子黄精颗粒组组间差异(P<0.05),与其他组间差异(P<0.01)。三个补肾方药治疗组的smad4mRNA与GDF-9 mRNA表达,组间差异均没有统计学意义(P>0.05)。 第三部分 补肾方药对雷公藤多苷所致生殖损伤雌鼠生育力的影响 雷公藤多苷9mg/kg·d连续用药12周对雌性幼鼠成年后的交配、受孕、妊娠、分娩过程没有明显影响。GTW加六味地黄丸组的存活率与产仔数最大,各组间差异没有统计学意义(P>0.05)。各组活产率均为100％。 结论: 1. 雷公藤多苷对雌性幼鼠的生殖功能有损伤；损伤效应具有迟滞性和可逆性；损伤程度随剂量和疗程的增加而增加。并且雷公藤多苷在性成熟期前用药对雌性幼鼠成年后的交配、受孕、妊娠、分娩过程无明显影响。环磷酰胺的毒性远大于雷公藤多苷。 2. 雷公藤多苷可导致卵巢、子宫的组织形态损伤；抑制雌激素受体表达,降低卵巢子宫对激素调节的敏感性；抑制卵巢凋亡因子bcl-2表达,促进卵巢颗粒细胞凋亡,导致卵泡闭锁增加。 3. 本实验首次对雷公藤多苷对卵巢组织GDF-9mRNA与smad4mRNA表达的影响进行了观察,证实雷公藤多苷可以抑制卵巢组织中GDF-9mRNA、smad4mRNA的表达。 4. 补肾复方中药及中药提取物可以促进雷公藤多苷对雌性生殖功能损伤的修复。具体表现在修复被损伤的组织结构,促进雌激素受体表达,促进卵巢组织的bcl-2、smad4mRNA、GDF-9 mPdqA表达量。推测补肾方药是通过发挥整体调节作用,调节卵巢自身的自分泌-旁分泌网络平衡,而起到抑制颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁,促进卵泡的发育、分化、成熟,修复受损的卵巢功能,促进受损的雌性生殖功能恢复的作用。