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摘要脑源性神经营养因子(brainderivedneuotrophicfactor，BDNF)是1982年德国神经生物学家Barde等从猪脑中分离出来的小分子蛋白质，是神经营养因子家族中最具代表性的成员之一。BDNF在中枢神经系统发育过程中，对神经元的生存、分化、生长起重要作用，同时又维持着神经系统的生存和功能，并促进损伤后神经元的再生。当脑缺血后，机体在没有外来因素干预下，内源性BDNF可通过自身代偿调节，提高神经元抵抗缺血的能力，促进受损神经元的修复、再生，调节神经结构的重建，促进脑损伤后认知功能的恢复。但机体自身的代偿能力有限，持续时间较短，随着脑缺血时间的延长，内源性BDNF表达逐渐降低，由于神经细胞损伤后的修复过程及其后的生长必须经历较长时间，内源性BDNF及其受体酪氨酸激酶受体(trkB)的上调尚不足以防治脑缺血性损伤及其以后的细胞死亡。大量实验表明外源性BDNF具有同样的功能活性。应用外源性BDNF给药到达大脑发挥生物学功能将是治疗缺血性脑损伤的一个很有潜力的治疗方法。 然而由于血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)的存在，限制了大分子物质在血液和脑组织之间的自由交换，许多有治疗作用的化学药物、多肽和蛋白质包括BDNF及核酸类分子难以透过血脑屏障。 目前，国内外还没有能靶向中枢神经系统的生物大分子药物制剂。在动物实验研究中，可用局部注射给药或脑靶向免疫脂质体等方法将BDNF等生物大分子带过血脑屏障并发挥其生物功能。 蛋白转导域(Proteintransductiondomain，PTD)是一类可使生物大分子穿过细胞膜进入胞浆内发挥功能作用的寡肽。将PTD与蛋白质、多肽或DNA等分子共价连接后，PTD可将这些分子以一种不依赖受体和膜转运蛋白(transporter)的方式导入细胞。来源于HIV的TatPTD就是一种转导能力很强的蛋白转导域(本研究中简称TAT)。实验证明TatPTD介导的蛋白可以导入近乎所有的细胞，包括破骨细胞、外周血单核细胞及原代细胞等常规方法难以转染的细胞，甚至还可以穿过血脑屏障，其转导过程不需要能量。因此，TAT蛋白转导系统被认为是一种很有前途的运载工具，无论对于基础研究还是临床治疗，都有着非常广泛的应用前景。 为了探索应用TAT将脑源性神经营养因子带过血脑屏障到达脑实质而发挥其生物效能的可行性，本研究中利用前期工作中构建和纯化的TAT-脑源性神经营养因子融合蛋白(简称TAT-BDNF)注射到动物体内，观察其能否顺利地通过血脑屏障，以及在脑内的动态分布规律。同时，通过动物脑缺血模型的实验研究，观察TAT-BDNF及其改良衍生物NBT对脑缺血后神经元的保护功能。 目的： 1.观察体内注射TAT-BDNF融合蛋白后能否顺利通过血脑屏障进入脑内。 2.观察TAT-BDNF通过血脑屏障后在脑内动态分布规律。 3.观察进入脑内及神经元内的BDNF是否还具有生物学活性，能否对脑缺血后神经元坏死起保护作用。 方法： 1.小鼠尾静脉注射TAT-BDNF后于0.5h、1h、2h、3h、4h、6h六个时点观察进入脑内的TAT-BDNF在脑内的动态分布。 2.采用沙土鼠短暂前脑缺血模型，在缺血前和缺血后体内注射TAT-BDNF，观察和比较其对缺血后神经元坏死的保护作用。 3.采用大鼠大脑中动脉局灶性缺血模型，体内注射TAT-BDNF，以及其改良衍生物NBT，比较两者对局灶性脑缺血后神经元坏死的保护作用。并与目前临床常用的新型脑保护剂依达拉奉进行比较。 结果： 1.体内注射TAT-BDNF后能够顺利地通过血脑屏障，使其有效成分BDNF进入脑内。而单纯注射BDNF则不能通过血脑屏障。 2.尾静脉注射TAT-BDNF后0.5h在海马CA3、CA3齿状回的内侧出现一条BDNF表达阳性的条带。随后1h、2h、3h、4h在CA1、CA2、CA3、CA4和齿状回的神经元和颗粒细胞先后出现BDNF阳性表达。 3.同时，在皮层、丘脑腹后核、杏仁核、下丘脑、梨状皮层等结构的神经元和胶质细胞出现BDNF阳性表达。 4.上述区域的BDNF表达在2h、3h、4h为表达高峰，6h这些区域的阳性表达明显消退。 5.在沙土鼠短暂性前脑缺血的实验中，提前2h体内注射TAT-BDNF组能显著地对缺血后神经元的坏死起保护作用，能减少前脑神经元坏死约22.69％。其次为缺血后0h给药组，能减少前脑神经元坏死约18.70％。而缺血后1h给药组，仅能减少前脑缺血后神经元坏死10.57％。说明短暂性前脑缺血后越早注射TAT-BDNF，其神经元的保护效果就越好。单纯体内注射BDNF对缺血后神经元的坏死没有保护作用。 6.在大鼠局灶性缺血模型的实验中，TAT-BDNF的改良化学物NBT对缩小局灶性缺血后梗塞灶的体积有显著的效果，能缩小半球梗塞灶体积62.66％，其中能缩小皮层梗塞灶体积63.95％，缩小皮层下梗塞灶体积59.42％。其次为TAT-BDNF，其能缩小半球梗塞灶体积32.78％，其中缩小皮层梗塞灶体积34.88％，缩小皮层下梗塞灶体积27.54％。与其对照，目前临床上常用的新型脑保护剂依达拉奉，其能缩小半球梗塞灶体积仅为14.52％，其中缩小皮层梗塞灶体积12.79％，缩小皮层下梗塞灶体积18.84％。 结论： 1.体内TAT-BDNF后能顺利地通过血脑屏障进入脑内。单纯注射BDNF则不能通过血脑屏障。 2.TAT-BDNF进入脑内先后分布在海马、皮层、丘脑、杏仁核等多个区域。2h、3h、4h为这些区域BDNF的表达高峰期，6h这些区域的阳性表达明显消退。 3.进入脑内的BDNF同样具有生物学活性。体内注射TAT-BDNF能对沙土鼠短暂性前脑缺血后神经元的坏死起保护作用，而且越早给药，效果越好。 4.TAT-BDNF的改良衍生物NBT显示出比TAT-BDNF更好的神经元保护活性。在大鼠局灶性脑缺血的实验中，注射NBT对缩小梗塞灶体积的效果最好，其次为TAT-BDNF。两者对缺血神经元的保护作用均优于目前常用的临床新型保护剂依达拉奉。