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摘要本研究分为以下三部分： 第一部分：蛋白偶联受体GPR40在成年猴中枢神经系统中的表达 背景与目的： G蛋白偶联受体(GPRs)是人体内最大的膜受体蛋白家族，是一类具有7个跨膜螺旋的跨膜蛋白受体，GPRs的结构特征和在信号传导中的重要作用决定了其可以作为很好的药物靶标。现已知其通过游离脂肪酸起着重要的生理作用。作为多元不饱和脂肪酸的特异性受体GPR40是GPRs超家族中的一个成员，伴随着GPR41和GPR43的发现，GPR40被确定在人类染色体组CD22下游的19q13.1。Briscoe等证实了人类组织包括胰腺和脑高表达了GPR40mRNA，而且证实可以被长链脂肪酸所激活。在胰腺，GPR40影响着胰腺的分泌，然而在中枢神经系统中情况并不清楚。 作为最近被确认的多元不饱和脂肪酸受体GPR40，除胰腺外，它的基因被报导优先表达于人的脑中。然而，多元不饱和脂肪酸在中枢神经系统中的可能涉及到GPR40受体的激活和GPR40在中枢神经系统中的作用并不清楚。这里，我们研究了GPR40在成年猴中枢神经系统的表达与分布。 方法： 根据GeneBank中人的GPR40序列(AccessionNo.NM_005303)设计引物及构建羊抗人GPR40多抗体，用体重5-11kg的成年猴(Macacafuscata日本猴)6只，雌雄不限，年龄约6-10岁，通过RT-PCR、Westernblotting和免疫组化，分别从基因和蛋白水平分别测定GPR40在成年猴中枢神经系统中的表达和分布。 结果： 本研究中，我们用RT-PCR检测出人的GPR40基因表达于成年猴的中枢神经系统，如脊髓，小脑，皮质，杏仁核，侧脑室下区及海马的CA1和DG区域。同时，我们根据定位于人的GPR40的C端独特的12氨基酸抗原决定簇构建了羊抗人GPR40的多克隆抗体，这个抗体在阳性和阴性对照中被Westernblotting所证实。Westernblotting分析显示这个抗体为分子量为31KD的条带，广泛地表达于中枢神经系统，如大脑皮质、海马、杏仁核、下丘脑、小脑、黑质、桥脑、髓质、脊髓和垂体。有兴趣的是GPR40在SVZ和DG这两个成年脑神经再生的区域也被检测到。组织免疫荧光分析显示GPR40免疫活性广泛地分布于神经元的细胞核和/或胞浆，这些神经元包括大脑皮质、海马、杏仁核、下丘脑、小脑和脊髓。在灰质的杏仁核和大脑皮质的分子层，GPR40免疫活性也表达于神经元细胞的树突。令人感兴趣的是，大脑白质以及大脑皮质的分子层和多形细胞层星形细胞也都表达了GPR40免疫活性。而且，SVZ和SGZ区域的星形细胞也表达了GPR40。另外，脑和脊髓的软脑/脊膜及室管膜细胞也表达了GPR40强阳性。 结论： 本研究结果显示GPR40广泛表达于成年灵长类动物的中枢神经系统。这个受体除了能介导细胞间代谢外，这个受体的分布暗示了自由脂肪酸作为细胞外的信号分子来调节神经功能。有兴趣地的是，GPR40表达于成年神经干细胞niche的星形细胞，如成年脑的SVZ和SGZ区域，暗示了GPR40可能涉及到成年神经再生的调节。 第二部分：GPR40在脑缺血后成年猴海马神经干细胞Niche表达 背景与目的： 自由脂肪酸受体GPR40家簇包括GPR40、GPR41、GPR43和GPR120超家族成员，已知作用于FFA起着重要生理功能。伴随着GPR41、GPR43和GPR120的发现，GPR40被确定定位于人类染色体CD22下游19q13.1。GPR40基因被报导优先存在于脑和胰腺中。我们前期研究也首先从蛋白水平证实了GPR40广泛地达于灵长类动物成年猴的中枢神经系统。最近三个独立小组证实GPR40的配体是中长链脂肪酸如DHA和ARA。 流行病学调查和动物实验证实多元不饱和脂肪酸对正常的脑功能起着关键性的作用。如用含ARA的膳食疗法给成年鼠，可以改善它的空间记忆和海马的长时间记忆潜能。高水平存在于哺乳动物脑中的DHA不仅对促进神经发展和维持神经功能起着关键性的作用，而且也有利于神经元抗凋亡作用和防止缺血性脑损伤。而且多元不饱和脂肪酸对脑病理状态的神经功能的保护作用也被提出。最近体外实验研究表明在人乳腺细胞系，通过GPR40途径，不饱和脂肪酸能够刺激而饱和脂肪酸却抑制细胞的增殖。然而很少研究GPR40在脑中的表达和功能及它在脑中的功能仍然不清楚。因此，研究生理和病理状态下脑中GPR40受体作用的分子机制有着重要的实用价值。 本实验利用成年灵长类动物短暂性脑缺血模型，旨在研究成年灵长类动物海马中的神经再生环境niche的GPR40表达且该受体在短暂性脑缺血后成年神经再生nihce中变化。 方法： 用体重5-11Kg成年猴30只，雌雄不限，建立短暂性全脑缺血模型，并随机分成以下5组：Ⅰ.假手术组；Ⅱ.缺血后4天组(d4组)：Ⅲ.缺血后7天组(d7组)；Ⅳ.缺血后9天组(d9组)；Ⅴ.缺血后15天组(d15组)。所有组按时给食和自由饮用水，建立模型后在相应时间点处死猴。用Westernblotting和免疫组化检测GPR40活性及其与特定的细胞的共表达情况。 结果： 结果显示GPR40表达于正常和缺血后成年猴的海马神经再生niche。用荧光共聚焦显微镜进行免疫组化分析显示GPR40表达于在成年脑神经再生环境SGZ区域的神经干细胞，不成熟的神经元细胞，星形细胞和血管内皮细胞且在脑缺血后活性上调。Immunoblotting分析显示GPR40蛋白在短暂性脑缺血后2周内有统计学意义地增高(相对于对照组)。这些结果与先前短暂性全脑缺血后神经再生数据相一致。 结论： 本研究最大的收获发现GPR40表达于成年灵长动物猴海马神经再生Niche且Westernblotting和免疫组化分析在短暂性全脑缺血后两周内活性上调，这与先前的脑缺血后成年神经再生数据相一致。这些平行数据提示了PUFA如DHA可通过GPR40来调节成年灵长类海马的神经再生。这将打开GPR40涉及上调脑缺血后神经再生的新视野。 第三部分：DHA能介导GPR40转染PC12细胞内的钙离子动员 大量流行病学调查和动物实验表明多元不饱和脂肪酸(Polyunsaturatedfreefattyacids，PUFA)对促进脑的发育和维持脑的功能起着关键性的作用。例如DHA(Docosahexaenoicacid)不仅是促进神经发育和维持正常神经功能所必需的，而且还能防止脑缺血的损伤。PUFA的膳食补充疗法可能影响细胞间和细胞内信号途径以及细胞膜的流动性，然而其在脑中的分子机制目前仍然不清楚。 最近，我们报导了作PUFA的一种蛋白偶联受体GPR40表达于灵长类动物猴的中枢神经系统和短暂性全脑缺血的海马神经再生SGZ区域。这将打开PUFA可能作为一个细胞间信号分子通过GPR40受体来介导神经元的功能的新视野。尽管有关证据证实了两者紧密相关，然而其详细作用的分子机制并不清楚。因此，更进一步地研究两者的分子机制是本研究的目的。这里我们首先研究DHA是否能诱导GPR40转染PC12细胞内的钙离子动员。 方法： 本研究首选拟构建GPR40基因质粒，用构建GPR40基因转染PC12细胞后，采用RT-PCR和Western印迹从mRNA和蛋白质水平观察GPR40的表达；对野生型PC12细胞、空质粒转染组和GPR40基因转染组，分别给予DHA(50μM)干预后，测定细胞内钙离子浓度。 结果： 结果显示DHA对野生型PC12细胞和空质粒转染组PC12细胞内钙离子浓度没有显著影响；而能迅速动员GPR40基因转染PC12细内的钙离子浓度，这种作用不受细胞外钙离子浓度的影响且能被IP3受体特异性阻止剂XesC所阻断。 结论： DHA能动员GPR40基因转染PC12细胞内钙离子浓度且这种作用完全能被IP3受体特异性阻止剂所阻断。提示DHA可能通过GPR40信号途径动员细胞内钙离子来改善神经功能。