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摘要研究背景和目的： 脓毒症具有较高的死亡率，严重危害人类健康。目前研究表明：脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活单核/巨噬细胞引起的细胞因子过度释放是临床上脓毒症的主要原因之一。LPS进入体内后主要是通过与脂多糖结合蛋白(LPS-bindingprotein，LBP)结合转运到细胞膜上，与分泌型蛋白MD-2、膜上的CD14、TLR4(Toll-likereceptor4)等分子结合，形成结合有LPS的受体复合体，由TLR4胞内段与MyD88结合启动LPS信号转导通路，最终引起NF-kB的活化，引起促炎症细胞因子的释放，使得炎症反应放大。髓样细胞表达的触发受体-1(triggeringreceptorsexpressedonmyeloidcells-1,TREM-1)是新近发现的能放大炎症反应的又一重要分子，对LPS等细菌产物引发的急性炎症发应有显著放大作用，该分子被认为可能是拮抗脓毒症的重要靶分子之一。 TREM-1分子选择性表达于中性粒细胞、CD14+单核/巨噬细胞表面，分子表面有三个抗体等效互补决定区(antibody-equivalentcomplementaritydeterminingregion，CDR)。该分子在体内有两种存在方式：膜结合型和可溶型，可溶型的TREM-1相当于膜结合型的胞外区。膜结合型TREM-1的活化需要LPS和位于血小板上的未知配体协同作用，活化后能显著上调促炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、GM-CSF)和趋化因子(IL-8、MCP-1)的持续分泌及髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的释放，引起中性粒细胞脱颗粒、呼吸暴发和吞噬反应，并抑制抗炎因子IL-10的表达；而可溶型TREM-1的功能则是抑制促炎症细胞因子的产生，对败血症动物模型有保护作用。TREM-1分子的氨基酸的保守性分析发现CDR1附近的氨基酸序列也较为保守，而该区域的功能目前还无报道，该区域是否参加了TREM-1分子与LPS或天然配体的作用目前尚不明确。因此本研究拟通过原核表达得到小鼠TREM-1CDR1保守区融合蛋白，并进行纯化及相应的初步鉴定，为研究该区域的功能奠定基础。 主要技术方法： 从正常成年昆明小鼠组织中提取细胞基因组DNA，利用PCR技术扩增出小鼠TREM-1分子CDR1保守区基因片段。构建好PET-30a(+)-CDR1原核表达载体，并转化到BL21(DE3)plysS大肠杆菌中通过IPTG诱导表达。表达产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测分析鉴定。超声碎菌法对目的融合蛋白进行分离，并进行亲和层析纯化，最后经过透析复性获得目的融合蛋白。 结果： 1.通过对小鼠TREM-1的同源性分析发现，CDR1附近较保守的氨基酸残基主要位于羧基端的第31-56位，由DNAMAN软件比对该区域的DNA和cDNA序列，发现其位于同一外显子，故以小鼠基因组DNA为模板，确定扩增编码18-63位的氨基酸的核苷酸序列。 2.采用PCR技术，以小鼠基因组DNA为模板，扩增得到了编码小鼠TREM-1含CDR1的保守区的长176bp的基因序列，其中含限制性酶切位点、原核终止密码子等。 3.将该基因序列与原核表达载体pET30a(+)双酶切后，连接产物转化DH5α大肠杆菌，小量提取质粒，序列测定结果表明成功构建了pET-30a(+)-CDR1表达载体。 4.构建好的质粒成功转化表达菌BL21(DE3)plysS，通过IPTG诱导阳性菌株进行表达，并优化表达条件，确定了最适宜的表达条件为30℃减慢诱导7h。电泳结果表明，重组阳性菌诱导后表达出约12kD大小的新生融合蛋白带，与预期融合蛋白分子量相符。Westernblot鉴定结果显示该蛋白与小鼠anti-His单克隆抗体有特异性结合能力。 5.应用Qiagen公司的Ni-NTAagarose，经pH梯度洗脱进行含6×His标签融合蛋白的亲和层析纯化。经含GSH/GSSH的透析液透析复性，获得小鼠TREM-1含CDR1的保守区融合蛋白。 结论： 1.成功构建小鼠TREM-1含CDR1保守区基因的原核表达载体，并在BL21(DE3)plysS大肠杆菌中稳定大量表达； 2.率先研究发现：含小鼠TREM-1CDR1保守区的目的融合蛋白主要以可溶性蛋白形式表达，并说明通过原核表达获得含该区域的融合蛋白是可行的。 3.经Ni-NTAagarose亲和层析纯化，获得小鼠TREM-1含CDR1保守区的融合蛋白，为研究小鼠TREM-1含CDR1保守区的功能奠定了基础。