检索历史 清除

摘要缺氧性肺血管收缩(hypoxicpulmonaryvasoconstriction，HPV)主要是肺动脉平滑肌细胞(pulmonaryarterysmoothmusclecells，PASMCs)收收缩。缺氧引起的PASMCs胞浆游离钙离子浓度([Ca2+]i)升高是HPV的关键。线粒体是细胞内重要的钙贮存库，在调节[Ca2+]i中起重要作用。线粒体具有十分完善的Ca2+摄取和释放系统，可以敏感而快速地感受细胞内Ca2+信号的变化。有文献表明，线粒体及线粒体钙离子浓度([Ca2+]mit)在HPV的发生中扮演重要的角色，但缺氧时[Ca2+]mit的变化规律及其机制，国内外研究较少。因此，本实验对缺氧时PASMCs[Ca2+]mit的动态变化特点进行了观察，并对其机制进行了初步研究。 方法：实验分三部分： 第一部分分离成年Wistar大鼠PASMCs进行体外培养，将PASMCs分为三组：分别负载细胞膜电位荧光指示剂Di-8-ANEPPS(2μmmol/L)、胞浆ca2+荧光指示剂Fluo-4/AM(4μmol/L)和线粒体Ca2+荧光指示剂Rhod-5F(5μmol/L)。利用连二亚硫酸钠(Na2S2O4，终浓度2mmol/L)，对细胞进行化学缺氧干预，在激光共聚焦显微镜下观察缺氧环境下细胞膜电位、[Ca2+]i和[Ca2+]mit的动态变化。 第二部分分离成年Wistar大鼠PASMCs进行体外培养，将PASMCs分为三组：分别负载细胞膜电位荧光指示剂Di-8-ANEPPS(2μmmol/L)、胞浆Ca2+荧光指示剂Fluo-4/AM(4μmol/L)和线粒体Ca2+荧光指示剂Rhod-5F(5μmol/L)。分组施加终浓度为18mmol/L的KCl使细胞去极化，在激光共聚焦显微镜下观察去极化时细胞膜电位、[Ca2+]i和[Ca2+]mit的动态变化。 第三部分分离成年Wistar大鼠PASMCs进行体外培养，将PASMCs分为三组：分别负载细胞膜电位荧光指示剂Di-8-ANEPPS(2μmmol/L)、胞浆Ca2+荧光指示剂Fluo-4/AM(4μmol/L)和线粒体ca2+荧光指示剂Rhod-5F(5μmol/L)。每组分别施加终浓度为10-6mol/L血管紧张素II(AngII)和终浓度为100μmol/L一氧化氮供体(SIN-1)，在共聚焦显微镜下观察舒缩血管活性物质作用时细胞膜电位、[Ca2+]i和[Ca2+]mit的动态变化。 主要结果： 一、缺氧时PASMCs细胞膜电位、[Ca2+]i和[Ca2+]mit的动态变化 1.用Na2S2O4对PASMCs施加缺氧刺激后，PASMCs细胞膜电位荧光强度迅速大幅度降低，继而迅速回升，于100s时升至峰值且高于初始水平，随后逐渐下降低于初始水平。 2.缺氧时PASMCs[Ca2+]i荧光强度逐渐持续增高；同时[Ca2+]mit荧光强度也逐渐持续波动性增高两者升高的方式具有较高的一致性。 二、KCl去极化时PASMCs细胞膜电位、[Ca2+]i[Ca2+]mit的动态变化1.加入终浓度为18mmol/L的KCl后，PASMCs细胞膜电位荧光强度迅速增高，至60s时达高值，随后逐渐下降，但在所观察的时间内细胞始终处于部分去极化状态。 2.加入终浓度为18mmol/L的KCl后，PASMCs[Ca2+]i和[Ca2+]mit迅速升高，于60s左右达高值，随后逐渐下降。二者变化方式基本与膜电位相同。 三、舒缩血管活性物质对PASMCs细胞膜电位、[Ca2+]i和[Ca2+]mit的动态变化的影响1.AngIIPASMCs细胞膜电位、[Ca2+]i和[Ca2+]mit的动态变化的影响 (1)向PASMCs培养液中加入终浓度为10-6mol/L的AngII基本不影响细胞膜电位。 (2)加入终浓度为10-6mol/L的AngII可使PASMCs[Ca2+]i荧光强度迅速增强，50s时达到高峰，继而下降并维持在初始水平。 (3)加入终浓度为10-6mol/L的AngII可使PASMCs[Ca2+]mit呈升高、降低和回升的三相改变：[Ca2+]mit迅速小幅度升高，于20s左右达峰值并开始降低，于100s左右至最低，形成低谷平台，持续至400s左右逐渐回升，于600s左右恢复接近初始水平。 2.NO对PASMCs细胞膜电位、[Ca2+]i和[Ca2+]mit的动态变化的影响 (1)加入终浓度为100μmol/L的SIN-120s后，PASMCs膜电位荧光强度迅速大幅度减弱，200s时达到最低，并维持在这一水平。 (2)加入终浓度为100μmol/L的SIN-1所引起PASMCs[Ca2+]i荧光强度变化基本与膜电位变化相同。 (3)加入终浓度为100μmol/L的SIN-120s后，PASMCs[Ca2+]mit迅速降低，80s时降至最低，形成低谷平台持续至160s时开始回升，于200s时回升至平稳水平但仍低于初始值。 结论： (1)缺氧时[Ca2+]mit可能主要受[Ca2+]i的影响而逐渐增高。 (2)缺氧时[Ca2+]i、[Ca2+]mit的变化不能单纯用缺氧降低细胞的膜电位来解释。(3)[Ca2+]mit的变化可能是缺氧时AngII和NO调节肺血管张力的机制之一。