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摘要本研究针对人类SMPD1基因，设计合成了6对siRNA，分别以人成纤维细胞和颗粒细胞对其基因沉默效率进行筛选，获得2对理想的siRNA，进一步检测了它们在成纤维细胞中发挥作用的量效和时效关系。以丝裂霉素诱导的人卵巢颗粒细胞凋亡模型作为研究对象，按照摸索的最佳量效和时效关系，利用优选的siRNA转染细胞，观察细胞活力和细胞凋亡的情况。结果显示，siRNA对细胞毒性药物引起的人卵巢颗粒细胞凋亡具有明显的保护作用。本研究包括三个部分，详述如下： 第一部分细胞原代培养、鉴定及SMPD1的检测 [目的]:分离、纯化、培养人包皮成纤维细胞和人卵巢颗粒细胞，为进一步的siRNA筛选，沉默效率检测及RNA干扰实验提供细胞模型奠定方法学基础。 [方法]: 1.应用胰酶及胶原酶联合消化法进行原代人包皮成纤维细胞的分离培养，通过形态学观察和波形蛋白(Vimentin)免疫荧光检测对其进行鉴定。 2.应用密度梯度离心及胰酶消化法进行原代人卵巢黄素化颗粒细胞的分离培养，通过形态学观察和卵泡刺激素受体(FSHR)免疫荧光法检测对其进行鉴定。 3.通过RT-PCR检测SMPD1基因的mRNA，免疫荧光检测SMPD1的蛋白以确定两种细胞内源性表达靶基因。 [结果]:成纤维细胞贴壁生长，排列成束状或漩涡状。其波形蛋白阳性率达到96％。人卵巢颗粒细胞贴壁，呈星形生长，胞浆富含颗粒。FSHR的阳性率为75％～85％。两种细胞均有SMPD1基因mRNA及蛋白的表达。 [结论]:本实验成功地进行了原代人包皮成纤维细胞和人卵巢颗粒细胞的培养，细胞纯度高，内源性表达SMPD1基因，可作为细胞模型应用于进一步的siRNA筛选、鉴定及RNA干扰实验。 第二部分siRNA的设计和筛选 [目的]:以人包皮成纤维细胞为模型，通过设计合成，实验筛选，获得高效、特异沉默SMPD1基因的siRNA，通过观察siRNA对靶基因转录产物和翻译产物沉默的量效和时效关系，系统了解sirNA在细胞内的时空作用方式及代谢特征，为进一步优化实验方案，获得最佳的实验结果提供实验数据，为下一步细胞凋亡保护实验奠定基础。 [方法]: 1.针对SMPD1特异序列设计合成6对siRNA，另设随机序列作为阴性对照(notargetsiRNA，NTsiRNA)。 2.用阳离子脂质体(Lipofectamine2000)作为转染试剂，荧光标记的dsRNA低聚体(Fluorescentoligo)作为转染效率的指示剂进行转染条件的优化和转染效率的检测。不同浓度oligo(40nmol/L,60nmol/L,80nmol/L，100nmol/L)和lipofectamine2000(0.5μL，1μL，1.5μL)共转染细胞，转染后6h荧光显微镜下观察、计数，计算阳性细胞率。免疫荧光观察转染后细胞形态，流式细胞仪定量检测转染效率。 3.有效siRNA筛选：按照优化的转染条件，实验组为siRNA1至sirNA6共6组，设立NTsiRNA对照，脂质体对照。siRNA浓度为50nmol/L，转染48h后进行荧光定量RT-PCR检测SMPD1mRNA水平变化，转染72h后行WesternBlot检测SMPD1蛋白水平的变化。 4.siRNA量效关系：用筛选出靶基因沉默效率最高的siRNA，以不同浓度siRNA(0.5、5、50、100nmol/L)转染细胞，分别以NTsirNA、脂质体及Fluorescentoligo为对照，转染后6h观察荧光oligo的强度以确定转染效率不低于80％，转染后24h进行荧光定量RT-PCR，以脂质体组为对照计算抑制率，绘制量效曲线。 5.siRNA时效关系：使用最佳siRNA的最佳浓度转染细胞，分别以NTsiRNA、脂质体及Fluorescentoligo为对照，于转染不同时间(12、24、48、72h)后收集细胞，进行荧光定量RT-PCR的检测。以脂质体组为对照计算抑制率，绘制时效曲线。 6.siRNA对蛋白水平变化的时效关系：细胞转染siRNA，转染后不同时间点(24、48、72、96h)进行细胞总蛋白提取，BCA法进行蛋白质定量。用蛋白印迹法进行SMPD1蛋白的检测，β-actin作为内参。 [结果]: 1.在人包皮成纤维细胞，lipofectamine20001.0μL可以达到最佳转染效率，其值为98.3％。 2.在人包皮成纤维细胞中各条siRNA对SMPD1基因mRNA表达均有抑制作用，其中siRNA1的抑制率最佳，为96.29±4.58％。蛋白表达水平变化与mRNA一致。 3.siRNA浓度在0.5～50nmol/L之间目的基因的抑制率是逐渐上升的，当siRNA浓度达到100nmol/L时，抑制率下降，而阴性对照NT、siRNA的抑制率则上升。用50nmol/L浓度的siRNA转染细胞，mRNA在48h后达到最大的抑制率，蛋白在转染72h后达到最大的抑制率，96h恢复正常。β-actin各组无差异。 [结论]:在人包皮成纤维细胞达到最佳抑制效率的siRNA序列是siRNA1。靶向SMPD1的siRNA最佳作用浓度为50nmol/L。SMPD1基因mRNA水平在48h达到最大抑制率，蛋白水平在72h达到最大抑制率，其后SMPD1表达逐渐恢复到转染前水平。 第三部分靶向SMPD1的siRNA对颗粒细胞凋亡的保护作用 [目的]:通过观察靶向SMPD1的siRNA对化疗药物丝裂霉素诱导的颗粒细胞凋亡的保护作用，从细胞水平上评估siRNA对女性生殖保护的潜能，为将来的动物整体实验奠定基础。 [方法]: 1.转染条件的优化和转染效率的检测。不同浓度oligo(40nmol/L，60nmol/L，80nmol/L，100nmol/L)和lipofectamine2000(0.5μL，1μL，1.5μL)共转染细胞，转染后6h荧光显微镜下观察、计数，计算阳性细胞率。免疫荧光观察转染后细胞形态，流式细胞仪定量检测转染效率。 2.有效siRNA筛选：按照优化的转染条件，实验组为sirNA1至sirNA6共6组，设立NTsiRNA对照，脂质体对照。siRNA浓度为50nmol/L，转染48h后进行荧光定量RT-PCR检测SMPD1mRNA水平变化，转染72h后行WesternBlot检测SMPD1蛋白水平的变化。 3.丝裂霉素(MMC)致凋亡有效浓度的筛选：用不同浓度丝裂霉素干预细胞，24h后MTT法检测细胞活力，筛选出有效的药物浓度用于后续实验。 4.siRNA对丝裂霉素诱导的颗粒细胞凋亡的抑制作用：细胞接种24h后转染siRNA，转染48h后给予丝裂霉素，药物干预24h后收集细胞，分别进行Hochest/PI双染检测细胞凋亡形态，MTT法检测细胞活力，AnnexinV-PI双染行流式细胞检测细胞凋亡率。以同样浓度的NTsiRNA，脂质体为对照。 [结果]: 1.在人卵巢颗粒细胞，lipofectamine20001.5μL可以达到最佳转染效率，其值为61.6％。 2.在人卵巢颗粒细胞中只有siRNA3对SMPD1基因mRNA表达有抑制作用，抑制率为44.7±4.69％。蛋白表达水平变化与mRNA一致。 3.MMC浓度在15μg/mL时人卵巢颗粒细胞凋亡率明显增高，达到33.28％。 4.在阻断了SMPD1基因的表达后，siRNA3组活细胞染色明显增高，细胞存活率达到40.3％，与MMC组32.3％比较差异具有统计学意义。siRNA3组细胞凋亡率为44％，明显低于MMC组的68.3％。 [结论]: 靶向SMPD1的siRNA能够有效抑制丝裂霉素诱导的人卵巢颗粒细胞凋亡。