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果蝇PTIP基因功能的初步研究

摘要PcG蛋白最初在果蝇中被鉴定,此蛋白家族在维持Hox基因阻遏状态的过程中起关键作用。Trithorax蛋白家族与PcG蛋白的作用是相互拮抗的,它们在发育过程中激活Hox基因的表达。这两大蛋白家族必须通过一类称之为Polycomb反应元件(PRE)的顺式作用元件发挥作用。目前PcG及。TrxG蛋白家族对Hox基因的具体作用机制尚不明了,且是否对Hox以外的基因产生效应也还不清楚。 PTIP基因,全称为Pax2transactivationdomain-interactingprotein。实验表明:其对小鼠胚胎发育非常重要,且近期人们发现在哺乳动物中PTIP蛋白与ALR蛋白、MLL蛋白(果蝇Trithorax在哺乳动物中的同源物)形成的复合物具有组蛋白甲基转移酶(HMT)的活性。实验室已有的研究结果表明:果蝇中PTIP(CG32133,即dPTIP)对果蝇翅膀成虫盘A/Ppatteming的发育过程非常重要,并对Trithorax依赖性的基因如ubx的表达是必须的。因此认为:dPTIP可能在PcG/TrxG介导的基因表达调控的过程中发挥重要作用。本文试图进一步阐明在果蝇中PTIP基因的功能并从两个假说展开研究。 1.dPTIP是哺乳动物PTIP基因在果蝇中的同源基因。通过对多个生物物种的基因组序列进行了序列比对和分析,基于序列及蛋白结构域组成的相似性,发现PTIP样蛋白编码基因仅存在于进化相对高等的真核生物,包括昆虫、蠕虫和脊椎动物,但未发现存在于单细胞生物,如酵母。且PTIP样蛋白编码基因以独立拷贝的形式存在于基因组中。为了验证dPTIP与小鼠PTIP基因功能上的保守性,构建了儿株小鼠PTIP过表达(UAS-mPTIP)的转基因果蝇,并选择位于二号染色体的转基因果蝇品系进行下一步研究。利用已获得的dPTIP合子突变体果蝇所表现的蛹前期致死表型,运用hs-Ga14驱动UAS-mPTIP在dPTIP突变的背景上表达时,发现部分dPTIP功能缺陷的果蝇可以存活至成虫期。并通过RT-PCR和Westernblot验证,在驱动UAS-mPTIP转基因果蝇表达的个体中,mPTIP在转录及蛋白水平均有显著表达。这些结果表明:dPTIP与哺乳动物PTIP在功能上是保守的,dPTIP确实是哺乳动物PTIP的同源基因。因此,在果蝇中的研究结果将有可能推广到哺乳动物。 2.dPTIP对A/Ppatternimg至关重要且在体介导组蛋白甲基化修饰。已有的研究结果显示Engrailed(En)在dPTIP合子突变体果蝇的整个翅膀成虫盘均有表达,说明en在anterior出现了去阻遏现象。由于在哺乳动物中的研究结果表明PTIP协同激活基因的表达,因此,我们推测dPTIP对En的表达调控是间接的。通过原位杂交我们发现En的转录阻遏因子cubitusinterruptus(ci)在dPTIP合子突变体果蝇的翅膀成虫盘anterior部分的分布几乎完全消失。此外,dPTIP突变体唾液腺的免疫染色结果显示,H3K4三甲基化修饰水平明显下降,而H3K27的三甲基化修饰水平却显著增加。并且我们用Westernblot验证了H3K4的三甲基化水平的降低。这些结果提示我们dPTIP通过介导组蛋白修饰直接调控ci的表达进而参与A/P轴形态发生。由此我们认为PTIP通过在体介导组蛋白修饰而在特定的发育事件中发挥重要的作用。

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