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摘要紫草宁及其衍生物具有多种药理学活性，可以用来治疗创伤、炎症、皮肤疾病，近年来又发现其具有抗肿瘤、抗HIV病毒的活性。由于其所具有的独特药用价值，紫草宁及其衍生物在培养的紫草细胞中的合成以及代谢调控机理一直是人们研究的中心问题。在本研究中，我们从植物中存在的信号分子对次生代谢的调控为出发点，研究了信号物质对滇紫草细胞中紫草宁合成与代谢调控。 一氧化氮(Nitric oxide，NO)是植物中最近发现的一种新型自由基信号分子，它具有广泛的生理功能。在本研究中发现，NO信号分子参与了调控生长于M9液体培养基的滇紫草细胞中紫草宁的生物合成。应用电子顺磁共振技术——一种高度特异的测定生物环境中NO自由基的方法，在M9液体培养基中生长的滇紫草细胞内捕获了NO的特征信号；而在B5培养基中生长的细胞，几乎检测不到NO的发生。在M9液体培养阶段中，NO的信号在第2天最强，随着培养时间的延长，NO信号逐渐减弱，说明滇紫草细胞接种于M9培养基之后，发生了NO的合成。 采用药理学方法研究了滇紫草细胞内产生的NO信号分子与紫草宁合成之间的关系。首先，应用NO的发生剂—硝普钠(Sodium nitroprusside，SNP)处理滇紫草细胞。结果表明：0.04 mmol/L SNP于培养阶段的第4天加入到M9液体培养基中，显著地促进了紫草宁的合成，至培养阶段结束(第18天)，与对照相比，紫草宁的产量提高了78.1％；SNP也可以促进暗培养条件下，B5液体培养基中生长的滇紫草细胞合成紫草宁，于第4天加入到培养液中，培养18天后，紫草宁的产量比对照提高了151.9％，说明，NO对紫草宁的合成具有促进作用。一氧化氮合酶(NO synthase，NOS)抑制剂--左旋亚硝基精氨酸(Nω-Nitro-L-arginine，L-NNA)0.1 mmol/L、硝酸还原酶(Nitric reductase，NR)抑制剂--叠氮钠(Sodiumazide，SoA)0.05 mmol/L时，均在显著抑制紫草细胞中NO合成的同时，使紫草宁的产量分别下降了43.7％、38.7％，但两者均没有显著降低滇紫草细胞的活力。当SNP在0.01、0.04 mmol/L时能够减弱或者消除上述二者对紫草宁合成的抑制作用，说明L-NNA、SoA是由于抑制了NO的合成而抑制了紫草宁的产生。另外，PTIO(2-phenyl-4，4，5，5-tetramethyl-imidazoline-I-oxyl-3-oxide)作为一氧化氮的特异性清除剂，它在较大的浓度范围内(0.01-0.5 mmol/L)对滇紫草细胞的生长不具有细胞毒作用，在0.1 mmol/L、0.5 mmol/L时，紫草宁的产量分别下降了38.2％、56.4％，进一步说明，NO可能参与了诱导生长于M9培养基中的滇紫草细胞中紫草宁的合成。在前人的研究中，发现紫草宁的合成可以被真菌诱导子所促进。 在本研究中，我们从米曲霉、黑曲霉、青霉菌、禾谷丝核菌四种真菌的菌丝体中制备提取物，来作为诱导子处理演紫草细胞。发现来自于米曲霉的诱导子对紫草宁的合成具有抑制作用，而来自于其他三种真菌的菌丝体提取物均对紫草宁的合成表现出促进作用。黑曲霉诱导子对紫草宁的合成促进作用最强，在20 μg/mL时，培养阶段结束后，紫草宁的产量提高了80.1％；青霉菌诱导子在100μg/mL时，紫草宁的产量提高了53.5％；禾谷丝核菌诱导子在20-160 μg/mL时，对紫草宁的产量提高了25.9％-56.4％，其中在40 μg/mL时，具有最大的促进作用。诱导子对紫草宁合成的促进作用又受到其加入到培养基中的时间和M9培养基中铜离子浓度的影响。 在本实验中，我们研究了诱导子对促进紫草宁代谢的机理。采用来自于禾谷丝核菌的菌丝体提取物处理滇紫草细胞，诱导了NO的快速合成，在2小时后，就可以看到NO在处理后的细胞中明显高于对照组，而在处理后的8小时达到最大值，随后逐渐降低。诱导子诱导的NO合成持续约18小时。真菌诱导子处理紫草细胞48小时后，处理组中的紫草宁含量就显著高于对照组，在处理96小时之后，处理组与对照组中紫草宁的含量的差别达到最大值，紫草宁的产量提高了129.0-151.2％。随着培养时间的延长，诱导子对紫草宁的影响作用逐渐削弱。加入一氧化氮合成的抑制剂(L-NNA、L-NAME)，L-NNA在25-100 μmol/L时，诱导子对紫草宁的产量提高率相应降为106.8％—70.3％，L-NAME在12.5-100μmol/L时，诱导子对紫草宁的产量提高率相应降为47.4％—95.0％。NO的清除剂PTIO与诱导子共同处理滇紫草细胞后，也抑制了诱导子的作用。这表明NO可能参与了诱导子对紫草宁合成的诱导作用。到目前为止，已经从紫革细胞中克隆了编码紫草宁合成中的苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)、4-羟基苯甲酸香叶儿基转移酶(p—hydroxybenzoic acid geranyltransferase，LePGT)、甲戊二羟酸单酰辅A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR)。4-香豆酸CoA连接酶(4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL)、桂皮酸—4-羟化酶(cinnamic acid4-hydroxylase，C4H)的cDNA。在本实验中，我们应用RT—PCR的方法，研究了诱导子和NO对这些基因表达的影响。 结果表明诱导子可以促进PAL，LePGT，HMGR，4CL的表达，而对C4H的表达没有影响；NO可以促进PAL，LePGT，．HMGR的表达，对4CL、C4H的表达没有影响。NO可能通过调节以上代谢途径中的基因的表达来影响紫草宁的代谢调控。