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摘要本课题研究炎性细胞因子对肠上皮紧密连接的破坏作用，研究n-3多不饱和脂肪酸(二十二碳六烯酸DHA和二十碳五烯酸EPA)对炎性反应过程中紧密连接破坏的保护作用及其相关机制。 目前，肠上皮紧密连接完整性的测定主要通过测定大分子物质通透性。但这种方法存在缺陷，包括：通透性易受血流量、肾功能等因素的影响，个体差异大。因此，我们设计了一种新的测定动物肠组织上皮紧密连接完整性的方法，并应用该方法观察肠屏障功能损伤动物肠上皮紧密连接的改变。 第一部分 caco-2细胞模型的建立及紧密连接微区域的分离、鉴定 目的：Caco-2细胞的结构和生化特征都类似于人肠上皮细胞，Caco-2细胞的紧密连接和肠上皮紧密连接也十分相似，体外实验常采用Caco-2细胞进行肠屏障功能的研究，因此我们也采用此细胞株作为研究肠上皮紧密连接的细胞模型。本实验目的在于建立Caco-2细胞的模型并验证该模型是否可用于小肠上皮细胞紧密连接的研究。同时根据紧密连接微区域类似脂筏的理化特性，紧密连接微区域分离、鉴定，并研究Caco-2细胞紧密连接微区域的一些理化性质。 方法：Caco-2细胞培养采用高糖DMEM(Dulbecco's Modifled Eagle's Medium)培养基，添加10％灭活的新生牛血清，37℃，5％CO2的环境下培养，隔天更换培养液，4至5天后细胞生长达融合。接种到实验所需器皿(Transwell 培养板)上生长21天至形成完整紧密连接单层，用于跨膜电阻(TEER)、紧密连接等指标检验。Caco-2细胞紧密连接微区域的分离采用脂筏的分离方法，细胞破碎后经不连续蔗糖密度梯度超高速密度梯度离心，分离成10个组分，测定各组分蛋白含量、OD值(600nm)、脂筏标志蛋白(Flotillin-1)表达。 结论：培养的Caco-2细胞在形态上与小肠上皮细胞相似，电阻值符合要求，因而该Caco-2细胞模型可以作为肠粘膜上皮细胞的体外模型。所分离的3-6组分特性类似于脂筏结构的理化特性：富含蛋白、OD值(600nm)高峰，TX100不溶，脂筏标志蛋白阳性，为紧密连接膜微区域。 第二部分 炎性细胞因子处理后Caco-2细胞紧密连接的改变及n-3多不饱和脂肪酸的调控作用 目的：近年来研究发现，在炎性肠病、小肠移植排斥反应中，肠上皮紧密连接受到破坏，这种紧密连接的损伤与炎性细胞因子(IFN—γ/TNF—α等)作用密切相关，而炎性细胞因子破坏肠上皮紧密连接的分子机制尚不十分清楚。同时还发现，鱼油(n-3多不饱和脂肪酸)可以减轻炎性反应的损伤程度，但对于炎性反应造成的紧密连接损伤是否有效尚待研究。本实验目的在于研究炎性细胞因子处理后Caco-2细胞紧密连接结构和功能的改变，并初步研究n-3多不饱和脂肪酸对这种紧密连接损伤的调控作用。 方法：首先研究炎性细胞因子处理后紧密连接的改变，实验分为四组：对照组、TNF—α处理组、IFN—γ处理组和TNF—α与IFN—γ联合处理组。TNF—α处理组和IFN—γ处理组细胞分别用10 ng/mL TNF—α和100 U/mL IFN—γ处理72 h。细胞因子联合处理组用100 U/mL IFN—γ/处理19 h后，冉加入10 ng/mL TNF—α至72h。EVOM细胞电位仪测定细胞跨膜电阻抗(TEER)变化，透射电镜观察细胞紧密连接的超微结构改变。 其次研究单纯n-3多不饱和脂肪酸对细胞生长及紧密连接的影响。分别用EPA(25，50，75，100 μmol/L)，DHA(25，50，75，100μmol/L)和相同浓度的硬脂酸(做为阴性对照)处理细胞72h。观察细胞生长状念，流式细胞仪测定细胞增殖，EVOM细胞电位仪测定跨膜电阻抗(TEER)。 最后研究n-3多不饱和脂肪酸对炎性细胞因子处理后紧密连接损伤的调控作用。实验分为四组：对照组、TNF—α/IFN—γ处理组、DHA+ TNF—α/IFNγ联合处理组、EPA+TNF—α/IFN—γ联合处理组。EVOM细胞电位仪测定细胞跨膜电阻抗(TEER)变化，用透射电镜观察细胞紧密连接的超微结构改变。 结论：TNF—α和IFN—γ联合处理后紧密连接正常结构被破坏；高浓度DHA/EPA(75，100uM)处理会导致细胞生存率降低，TEER下降；低浓度DHA/EPA(25uM)处理可以减轻炎性细胞因子导致的紧密连接结构损伤和TEER下降。 第三部分 n-3多不饱和脂肪酸对Caco-2细胞紧密连接微区域蛋白分布、脂肪酸组成的影响 目的：研究发现，TJ的破坏总是伴随着TJ结构蛋白表达、分布的改变。最近Nusrat(2005)发现紧密连接部特异性蛋白Occludin和ZO-1在raft膜微区域(不溶于detergent糖脂raft膜微区域)中，即紧密连接膜微区域中，因此，可以通过对膜脂肪微区域(raft)的分离对紧密连接的结构功能进行研究，紧密连接膜微区域结构蛋白的分布改变是肠上皮紧密连接的改变和肠黏膜屏障功能改变的分子基础。 方法：实验分为四组：即对照组、IFN—γ/TNF—α处理组、DHA+IFN—γ/INF—α联合处理组、EPA+IFN—γ/TNF—α联合处理组。细胞处理后，经蔗糖密度梯度离心在250，000×g离心18h，分离山紧密连接膜微区域(3-6组分)。Western blotting测定紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、Claudin-4及脂筏标志蛋白Flotillin-1在紧密连接膜微区域中的表达分布。激光共聚焦显微镜观察Occludin、ZO-1蛋白在细胞中的分布。气相色谱分析紧密连接膜微区域中脂肪酸成分，液相色谱质谱联用分析紧密连接微区域中磷脂构成，分析DHA处理和EPA处理后紧密连接膜微区域脂肪酸、磷脂成分的改变。 结论：IFN-γ/TNF-α处理可使Occludin蛋白从紧密连接膜微区域移位到可溶膜组分中，并使Occludin表达去磷酸化；DHA、EPA可以部分抑制炎性细胞因子导致的Occludin蛋白移位。DHA/EPA使紧密连接膜微区域中多不饱和脂肪酸组分增加，尤其是增加了n-3 PUFAs的含量，改变了紧密连接膜微区域的脂肪环境。磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺分子中脂肪酰取代基团在DHA/EPA处理之后都有不同程度的改变。由此可见，n-3多不饱和脂肪酸处理改变了紧密连接膜微区域的脂肪环境，影响了紧密连接蛋白Occludin在膜亚区域的分布，为了解其免疫调节作用的影响提供了部分依据。 第四部分 大鼠肠上皮紧密连接检测方法的建立及紧密连接微区域的分离 目的：生物体内肠上皮紧密连接完整性的测定主要通过大分子物质通透性试验进行。但这种方法存在一定缺陷。本实验的目的是提供一种简单、准确、灵敏、有效的测定肠上皮紧密连接完整性的方法，同时利用体外实验的分离方法分离大鼠肠上皮紧密连接膜微区域；观察缺血再灌注损伤动物模型中肠上皮紧密连接的改变。 方法：测定肠上皮紧密连接完整性的方法。将测试肠段在充满95%O2/5％CO2的KRB缓冲液中沿对系膜缘剪开，小心浸洗去除肠内容物，暴露肠粘膜面，保持组织平展，粘膜面向外固定在测试杯杯口上，然后将测试杯倒置于培养池中。培养池分为上室和下室，分别加入200ul和1ml的37℃充满95％O2/5％CO2的KRB缓冲液。将STX2长电极插入下室，短电极插入上室，肠组织位于两个电极之间，保持位置恒定。测定三次取平均值。 分离大鼠肠上皮紧密连接膜微区域的方法。将小肠肠段沿系膜缘剪开，4℃KRB缓冲液浸洗，去除肠内容物和粘液，刮取上皮黏膜，收集细胞悬液，KRB缓冲液洗2次后，加入1ml细胞裂解液(1％TX100)，4℃30分钟，超声破碎，不同浓度蔗糖缓冲液依次覆盖，250，000×g于4℃下超速离心18 h。收集分离组分，测定各组分OD值(600nm)，及紧密连接蛋白Occludin的分布。 选用250-300g雄性SD大鼠，随机分为四组(每组8-10只)：对照组，缺血再灌注损伤1小时，2小时，4小时组。按上述方法测定各组大鼠末端回肠上皮电阻抗值，分离回肠上皮紧密连接膜微区域，测定Occludin蛋白在微区域的分布。透射电镜观察紧密连接形态，双糖实验、内毒素检测肠黏膜通透性。 结论：大鼠回肠肠上皮根据TX100可溶性做了初步分离，OD值(600nm)高峰范围和体外实验符合，并发现紧密连接蛋白Occludin的功能形式(磷酸化形式)主要分布于TX100不溶组分中，因此TX100不溶组分是紧密连接蛋白Occludin的功能区域，即紧密连接膜微区域。 大鼠回肠肠上皮电阻抗值和肠上皮通透性随缺血再灌注时间延长而降低，缺血再灌注早期出现紧密连接结构改变。这种改变伴随着紧密连接蛋白occludin的移位。