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摘要心肌梗死(myocardialinfarction，MI)，是指冠状动脉闭塞血流中断，部分心肌因严重而持久的缺血而发生局部坏死，导致了心肌细胞的不可逆的损伤和丢失以及瘢痕的形成，是引起充血性心力衰竭的主要原因。 急性心肌梗死的治疗，早期在于尽快挽救濒死的心肌防止梗塞面积扩大，缩小心肌缺血的范围。近十年来，随着对于细胞(stemcells)认识的不断加深，很多研究认为干细胞具有组织再生的功能，在体内能分化成为其他成熟细胞，如心肌细胞，血管内皮细胞等等，因此，用干细胞治疗心肌梗死的研究引起了大家的普遍关注。 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一种多能干细胞，在心肌微环境中可分化为心肌细胞和血管内皮细胞，同时它们可以释放促进血管生成和抗凋亡的因子，如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，肝细胞生长因子(hepaticgrowthfactor，HGF))和胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，IGF-1)等，从而激活内源性的修复机制，然而MSCs移植后的疗效不够理想，其低存活力大大限制了细胞治疗的效果。有研究通过基因修饰可以增强了MSCs的心肌保护作用，但其安全性和有效性仍然是有争论的。 以前的报道表明，缺氧在胎盘的发育过程中有着及其重要的作用，早期人类胚胎就发生在一个非常低的氧浓度的环境中。MSCs定居的骨髓也是一个含氧量低的环境，当MSCs的氧浓度减少到5％时增加了其骨形成的能力，用缺氧刺激MSCs增加了其旁分泌作用。因此我们推测经缺氧预处理(anoxicpreconditioning，AP)的MSCs，其心脏保护功能会进一步增加。 研究方法： 体内实验：骨髓MSCs由冲洗雄性的8周SD大鼠的股骨和胫骨骨髓腔并用密度梯度离心法分离获取。3-5次传代后贴壁的梭形骨髓MSCs得到扩增和纯化。移植前用流式细胞仪对骨髓MSCs进行检测。AP-MSCs缺氧(氧浓度<0.5％)3小时。移植细胞在体外用细胞核染料DAPI(50μg/ml)标记30分钟。体重约250g的成年雄性SD大鼠，开胸结扎左冠状动脉前降支，建立急性心梗模型。建模成功一周后再次开胸，随机分3组，分别在心梗周边区分3-5点注射150μlDMEM(n=16)，5×106MSCs/150μl(n=16)，或5×106AP-MSCs/150μl(n=16)。在移植后1周，行TUNEL染色评估心肌细胞凋亡，并对凋亡相关蛋白信号通路蛋白的westernblot分析来评价DMEM、MSCs和AP-MSCs三组的心肌细胞凋亡情况。在移植后4周，采用心脏超声评价大鼠的心功能情况；行HE染色，进行心梗面积计算，血管计数。 体外实验：采用分次消化法分离获取出生1-3天SD大鼠的心肌细胞，以差速贴壁法和Brdu抑制法提纯心肌细胞。十天后，心肌细胞随机分为三组进行缺氧再复氧实验：DMEM组、MSCs共培养组、AP-MSCs共培养组，缺氧24小时复氧3小时，对照组在含20％胎牛血清的DMEM中标准条件下培养27小时，用AnnexinV-FITC法检测心肌细胞的凋亡。 结果： 1.心肌细胞和骨髓间充质干细胞的形态和鉴定心肌细胞呈梭形、多角形，具有搏动能力；MSCs分离培养至第三代就较纯，显微镜下几乎见不到杂质细胞，进行细胞表面标记鉴定发现大多数细胞表达粘附分子CD44和CD90，而很少细胞表达造血细胞表面标记CD45，这结果符合MSCs的特征。 2.MSCs特别是AP-MSCs减少了缺氧再复氧诱导的心肌细胞凋亡正常培养的心肌细胞凋亡率低(2.16±0.78％)，缺氧再复氧后，心肌细胞凋亡明显增加(21.5±2.71％，vs正常培养组，P<0.05)，与MSCs共培养后其凋亡率降低(17.47±1.62％，vsDMEM组，P<0.05)，而与AP-MSCs共培养后其凋亡率进一步降低(11.01μ2.10％，vsDMEM组和MSCs组，P<0.05)。 3.MSCs和AP-MSCs对心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响MSCs特别是AP-MSCs提高了bcl-2/bax的比值，减少了缺氧再复氧后的心肌细胞的caspase-3的激活。 4.MSCs的移植后的体内追踪细胞移植后4周，在SD大鼠心肌内可见DAPI标记的MSCs或AP-MSCs，表明心肌注射成功，并有MSCs在心肌内定植。 5.MSCs特别是AP-MSCs减少了心梗后的心肌细胞凋亡心梗后心肌细胞凋亡明显增加(DMEM组：14.54±0.60％，vsSham组，P<0.05)，MSCs移植组凋亡减少(11.18±0.88％，vsDMEM组，P<0.05)，AP-MSCs移植组凋亡进一步减少(9.03±0.42％，vsDMEM组和MSCs组，P<0.05)。Western-blot检测也发现MSCs移植特别是AP-MSCs移植提高了bcl-2/bax的比值，减少了心肌caspase-3的激活。 6.MSCs特别是AP-MSCs移植改善了心梗后大鼠的心功能心梗后大鼠心功能明显下降(FS％20.94±1.20，vsSham47.64±1.55，P<0.05)，MSCs移植后心功能增加(FS％37.12±2.00，vsDMEM，P<0.05)，AP-MSCs移植更为明显(FS％43.32±1.82，vsMSCs，P<0.05). 7.MSCs特别是AP-MSCs移植减少心梗面积细胞移植后四周MSCs组心梗面积减少(38.76±1.42％，vs.DMEM组：47.30±2.63％，P<0.05)，而AP-MSCs组心梗面积进一步减少(32.8±1.67％，vsMSCs组，P<0.05)。 8.AP-MSCs移植增加了心梗后心肌的血管密度和VEGF的表达AP-MSCs移植组血管密度增加(6.10±0.23，vs.DMEM组.4.88±0.37和MSCs组：4.78±0.27，P<0.05)，并且VEGF表达增加。 结论： MSCs上调了缺氧后复氧的大鼠心肌细胞Bcl-2/Bax比例并抑制caspase-3的激活，从而减轻了心肌细胞的凋亡。缺氧预处理增强了这种作用。 MSCs移植对心肌梗死后的心功能恢复具有保护作用，对MSCs进行缺氧预处理可以增强这种保护作用。