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摘要本课题拟解决以下两个问题：1、通过高压氧暴露观察大鼠骨髓间充质干细胞细胞周期的影响；2、观察高压氧暴露对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的提取和纯化 方法:选用足月龄，体重约100g左右的雄性WISTAR大鼠，购自中科院动物所，用戊巴比妥麻醉之后将下肢浸泡于75％酒精15min后，取股骨，剪去两端骨骺，用含10％FBS的L-DMEM反复冲洗骨髓腔3次，收集冲洗液，600r/m离心5min，细胞悬液在浑浊状况下去除沉淀后1：1小心加在1.073比重的percoll分离液上，2500r/m离心20min，在上层红色培养液与下层白色percoll分离液之间有一层白色云雾状细胞层，吸走上层培养液，小心吸取云雾状细胞层，加培养液调整细胞密度到1.0×106/cm2种植于25ml培养瓶中。24h后第1次全量换液，随后每2～3d全量换液直至细胞长满瓶底80％-90％时用0.125％胰酶消化1～2min，镜下观察细胞开始悬浮并能随培养瓶晃动时加入含血清培养液终止消化，吹打后种植于新培养瓶，20min后再次全量换液，去除贴壁不牢的细胞，此时为原代细胞，记为P0，以后每传代一次记为P1，P2。取P3细胞消化离心，去除培养液，用PH7.6的PBS离心洗涤一次，分别加荧光素标记的抗CD31，CD44，CD45，CD90抗体，对细胞行单色荧光染色，37℃孵育30min，洗涤后用流式细胞术进行检测。 结果:1．骨髓腔冲洗液经percoll分离后种植于培养瓶，镜下观察红细胞较多，其中有部分折光率较高单个核体积较大的细胞，约20min后晃动培养瓶不随培养液浮动。经若干次换液，红细胞基本剔除，除了一些细胞碎片之外，大多数为单个核细胞，圆形、椭圆形、多边形，体积大小不一。每次传代消化种植于新培养瓶中20min后即刻换液，可使贴壁性不牢的细胞剔除。传至第2代，形态开始单一，呈长梭形、椭圆形、多边形并呈螺旋状或极性分布； 2．流式细胞术检测相关表面标志，结果显示：上皮细胞表面标志CD31阳性率为4.35％；基质类细胞表面标志CD44阳性率为98.15％；造血细胞表面标志CD45阳性率为6.69％，干细胞类表面标志CD90阳性率为99.07％，可认为CD31，CD45表达阴性，CD44，CD90表达阳性，提示该细胞为mMSCs。 第二部分大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化 方法:1．选择P0细胞，用含10μm5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)的10％FBS-L-DMEM培养，约3-4周后用免疫组化方法检测心肌钙蛋白T(cardiactroponin T，cTNT)及α-肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的表达。 2．选择P3纯化的mMSCs用含10μm5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)的10％FBS-L-DMEM培养，约3-4周后用免疫组化方法检测心肌钙蛋白T(cardiactroponin T，cTNT)及α-肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的表达。 3．阳性细胞计数：采用带有目镜测微尺的显微镜在100倍视野下进行细胞计数，每张片子随机观察10个视野，记录每个视野细胞总数和阳性细胞的总数。按下列公式计算出各抗体阳性率：阳性率(％)=阳性细胞/细胞总数×100％。 结果:1．诱导分化后3-4周，选用原代细胞和第三代mMSCs均可观察到与正常mMSCs存在显著不同，诱导后的细胞呈椭圆形或圆形排列，极少多边形，失去原有形态特征； 2．运用细胞荧光免疫方法，监测到各组均有心肌特异性标志心肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTNT)及α-肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的表达，但是选择原代细胞诱导的表达量较第三代rMSCs多。 第三部分高压氧对大鼠骨髓间充质干细胞细胞周期的影响 方法:1．选择第三代rat mMSCs，设立对照组、0.2MPa和0.3MPa高压氧暴露1h组，以及0.2MPa暴露24h恢复组和0.3MPa暴露2h恢复组； 2．一批细胞0.2MPa和0.3MPa暴露1h后立即消化成单个细胞，另一批细胞24h后再消化成单个细胞，置于75％酒精，4℃保存。 结果:1．各组中，3ATA暴露组细胞周期变化最明显，S期细胞减少，与对照组相比有统计学意义(P＜0.01)。 2．各组的24h恢复组的周期与对照组无明显统计学差异。 3．实验结果以均数±标准差表示。采用SPSS11.5软件包，进行多个样本均数比较，检验水准α=0.05。 结论:1．经HBO暴露后，通过流式细胞术检测显示，与正常对照组相比HBO能对rat mMSC细胞周期产生显著影响，其中0.3MPa暴露较0.2MPa显著，有统计学意义，其效果为S期细胞减少，提示DNA复制受到抑制； 2．待24h后再测定细胞周期显示，各组S期细胞与对照组相比无统计学上差异，0.3MPa暴露所产生的DNA抑制现象得到缓解，提示0.3MPa的HBO暴露所产生的DNA抑制现象是可逆的，可在24h后恢复。 第四部分高压氧对大鼠骨髓间充质干细胞分化的影响 方法:1．根据试验二选择P0细胞，用含10μm5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)的10％FBS-L-DMEM培养，向心肌样细胞诱导分化。 2．将细胞分为正常对照组、2ATA暴露组和3ATA纯氧暴露组，每天1h，连续20天。 3.3周后用免疫荧光方法检测心肌表面特异标志心肌钙蛋白T(cardiac troponinT．cTNT)及α-肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的表达。 4．阳性细胞计数：采用带有目镜测微尺的显微镜在100倍视野下进行细胞计数，每张片子随机观察10个视野，记录每个视野细胞总数和阳性细胞的总数。按下列公式计算出各抗体阳性率：阳性率(％)=阳性细胞/细胞总数×100％。 结果1．正常培养的mMSCs无cTNT及α-sarcomeric actin表达，用5-Aza诱导培养的对照组以及0.2MPa和0.3MPa的HBO暴露组均可获得cTNT及α-sarcomericactin表达阳性的细胞： 2．根据免疫荧光检测分化细胞阳性率显示，与对照组相比两组高压氧暴露对ratmMSCs向心肌样细胞诱导分化没有显著影响。 结论：在rat mMSCs诱导分化过程中，增加HBO暴露因素并不影响其向心肌样细胞分化，同时0.2MPa和0.3MPa的HBO暴露与对照组相比并未使cTNT及α-sarcomeric actin的阳性率出现统计学差异。