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摘要本文目的： 肾癌(Renal cell carcinoma，RCC)是常见的泌尿系肿瘤之一，占成人恶性肿瘤的2-3％.近年来研究发现肾癌是多基因相关肿瘤，其发生、发展的分子生物学机制尚不完全清楚.趋化因子是一类小分子量(8～14 kDa)蛋白质，它可以同源G蛋白偶联受体结合，引发细胞应答，研究发现趋化因子SDF-1结合其特异性受体CXCR4，不仅在宿主对病原因子的感染、组织修复和炎症反应，免疫细胞的发育、分化中起了重要作用，而且与多种肿瘤的发生、发展、趋化、迁移密切相关.SDF-1/CXCR4在肾细胞癌中的相互作用尚不完全清楚，在前期进行的实验中，我们首次发现经SDF-1处理24小时后，共聚焦显微镜下观察EGFP-CXCR4重组表达载体转染肾透明细胞癌A498细胞后表达产物由细胞质转移至细胞核，并研究肾癌病理标本发现：肾癌原发灶中CXCR4未出现核定位，而在肾癌转移灶中出现了CXCR4的核定位，我们推测SDF-1与CXCR4结合后，CXCR4向细胞核内转移，并直接或间接传递了某些信号，CXCR4在细胞核内的信号通路可能与肾癌转移相关.本实验拟构建不同长度区段的CXCR4重组表达载体初步寻找CXCR4可能的核定位序列，从而为探索抑制肾癌转移的可能靶标奠定基础. 方法： 应用核定位分析软件结合实验，寻找CXCR4可能的核定位序列，合成带有HindⅢ和BglⅡ酶切位点的引物，以EGFP-CXCR4为模板，运用PCR扩增相应的目的片段，并将目的片段连接至pMD19-T载体中，将重组T载质粒用HindⅢ和BglⅡ双酶切，同时将pEGFP-N1用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，由于BglⅡ与BamHⅠ粘性末端相同，将酶切后目的片段与pEGFP-N1连接，获得三个不同长度区段的CXCR4与绿色荧光蛋白pEGFP-N1重组表达载体.Fugene HD介导转染肾癌A498细胞，野生型全长EGFP-CXCR4(加SDF-1及不加SDF-1)及pEGFP-N1空载体转染24h加入SDF-1刺激因子刺激24h后共聚焦观察，重组表达载体EGFP-CXCR4(1～267bp)、EGFP-CXCR4(1～510bp)、EGFP-CXCR4(1～765bE)转染24小时加SDF-1刺激因子24h后共聚焦观察CXCR4不同区段重组表达载体在细胞内定位. 结果： 1、双酶切和测序结果表明CXCR4不同区段重组表达载体EGFP-CXCR4(1～267bp)、EGFP-CXCR4(1～510bp)、EGFP-CXCR4(1～765bp)构建成功，无碱基突变及读码框架的改变。 2、生物信息学分析软件PSORTⅡ Prediction发现第146至149氨基酸残基RPRK可能是CXCR4分子的核定位序列. 3、共聚焦显微镜观察CXCR4及pEGFP-N1空载体在A498细胞内定位情况： pEGFP-N1空载体转染A498细胞24小时后加入SDF-1(200ng/ml)刺激因子24小时其表达产物呈细胞均匀分布，未经SDF-1刺激野生全长EGFP-CXCR4转染A498细胞48h后其表达产物主要呈细胞质分布，野生型全长EGFP-CXCR4转染A498细胞24小时后加入SDF-1(200ng/ml)刺激因子24小时其表达产物呈细胞核聚集，部分定位于细胞质，EGFP-CXCR4在加入SDF-1出现核定位. 4、共聚焦显微镜观察不同长度CXCR4缺失体在A498细胞内定位情况： CXCR4不同缺失体转染A498细胞24小时加入SDF-1(200ng/ml)刺激因子24小时后观察，EGFP-CXCR4(1～267bp)表达产物主要呈细胞质分布，EGFP-CXCR4(1～510bp)、EGFP-CXCR4(1～765bp)表达产物主要呈细胞核聚集，部分定位于细胞质， 结论： 1、CXCR4的第90～170位氨基酸残基含有核定位序列，其影响在细胞内分布，为进一步精确定位核定位序列提供理论基础. 2、生物信息学分析RPRK有可能是CXCR4的核定位序列，但生物信息学的准确性有待进一步实验来验证。