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摘要目的： 半个世纪以来的研究表明卵巢组织的冷冻保存和卵巢移植是目前保留癌症患者生育能力的较好方法之一[1]。然而，由于没有血管吻合，移植的卵巢组织血供单纯依赖于移植后的血管新生和重建，移植后相当一段的时间内处于缺血缺氧状态而导致大量卵泡丢失，已成为阻碍移植卵巢组织功能恢复的关键问题[2]，因此如何减少移植卵巢组织的缺血损伤，诱导血管发生是冻融卵巢组织临床应用的研究热点和难点。传统中药丹参是一种常用的活血化瘀中药，它能清除自由基、改善血流变化和微循环状态，许多研究表明丹参对心、肝、肺等多种组织器官的缺血-再灌注损伤具有明显的改善作用。本实验通过丹参对冻融小鼠卵巢同种异体移植早期的干预研究，应用组织学及RT-PCR技术观察移植早期卵巢中抗氧化相关基因表达的变化及移植后卵巢形态学的改变来了解丹参注射液是能否通过其抗氧化功能改善卵巢移植早期的缺血损伤从而提高卵泡的存活率，探讨丹参干预的分子生物学机制，为人卵巢组织冷冻保存和临床应用提供实验依据。 方法： 实验由三个部分组成，第一部分：冻融过程对小鼠卵巢组织卵泡数量和凋亡的影响。新鲜组为B6C2F1第一天新生(D1)小鼠卵巢，冻融组为冷冻解冻后的新生小鼠卵巢，两组卵巢组织石蜡包埋后4μm连续切片，H染色在光学显微镜下进行总原始卵泡计数和凋亡(Tunel)的检测。第二部分：分别为14天新鲜组、14天回收移植对照组和14天回收移植丹参组。14天新鲜组为14天B6C2F1小鼠的新鲜卵巢，14天回收移植对照组和14天回收移植丹参组处理如下：收集B6C2F1第一天新生(D1)小鼠卵巢，慢冻速融后移植至B6C2F1代8-12周雄鼠的肾被膜下，移植前一天至回收当日分别给予受体小鼠腹腔内注射生理盐水0.5 ml和丹参注射液0.5 ml(含丹参0.15 g)，于移植后14天回收移植物行石蜡包埋，4μm连续切片，HE染色光学显微镜下进行各级卵泡计数和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化分析。第三部分：分别为移植对照组和移植丹参组，两组处理同第二部分，分别于移植后1d(24h)，2d(48h)和14d回收移植物，进行SOD(超氧化物歧化酶)和iNOS(诱导型一氧化氮合酶)的RT-PCR半定量测定。 结果： 一、冻融过程对新生小鼠卵巢卵泡数量和凋亡的影响 1、原始卵泡计数：新鲜组和冻融组初生小鼠卵巢中含大量的原始卵泡，与新鲜组相比，冻融组的总原始卵泡数有所下降，但两组间无显著性差异，P>0.05，分别为(7124±858) VS(6542±929)。 2、凋亡的检测：新鲜组和冻融组初生小鼠卵巢皮质区分散着少数凋亡细胞，冻融组卵巢中平均每高倍视野(×400油镜)下(12±2)个凋亡细胞略多于新鲜组(10±1)，但两者无显著差异。 二、丹参对冻融新生小鼠卵巢同种异体移植卵泡存活率及卵泡增殖的影响 1、PCNA免疫组化分析：14天回收卵巢移植物对照组和丹参组的阳性率分别为85-90％和80％-85％，两组无显著性差异。 2、各级卵泡计数及卵泡存活率：以14天新鲜卵巢作为基数，14天回收移植对照组和丹参组的原始卵泡明显减少，分别为(3550±250) VS(1340±60) VS(1730±180)，其中丹参组的原始卵泡数多于对照组，存在显著差异(P<0.05)，另外14天回收移植物行全卵巢卵泡计数和计算卵泡存活率，结果显示初级卵泡，窦前卵泡和窦卵泡，移植丹参组均多于对照组，分别为(1889±202) VS(2709±234)，(280±120) VS(560±65)，(249±23) VS(311±97)和(20±1)VS(48±7)，差异有统计学意义(P<0.05)。移植丹参组卵泡存活率显著高于对照组，为66.1％VS44.7％，差异有统计学意义，(P<0.05)。 三、丹参对冻融小鼠卵巢组织移植物抗氧化相关基因表达的影响 1、移植丹参组中各时间段的SOD-mRNA的表达均高于移植对照组，分别为(0.19±1.21) VS(0.45±0.23)，(0.20±0.11) VS(0.51±0.12)和(0.19±0.11)VS(0.50±0.21)，P<0.05存在显著性差异。 2、移植丹参组中各时间段的iNOS-mRNA的表达均低于移植对照组，分别为(0.30±0.05) VS(0.38±0.13)，(0.21±0.15) VS(0.47±0.03)和(0.16±0.03)VS(0.42±0.02)，P<0.05存在显著差异。 结论： 1、冻融前后初生小鼠卵巢的原始卵泡无明显减少，凋亡细胞无明显增加，表明本实验采用二甲亚砜(DSMO)作为冷冻保护剂的慢冻速融法适合小鼠卵巢的冷冻保存，且冷冻和解冻过程未造成原始卵泡的大量丢失。 2、移植对照组和移植丹参组14天回收的卵巢可见各级卵泡，表明原始卵泡均有发育，并到达窦卵泡阶段，增殖细胞抗原(PCNA)的检测证实了两组组织均处于良好的生长状态。但14d回收的两移植组卵巢中原始卵泡数及总卵泡数大大少于14d新鲜小鼠卵巢，证实了卵巢组织移植过程中由于无直接血管吻合导致大部分原始卵泡的丢失。其中移植丹参组14天回收的全卵巢卵泡计数和各级卵泡的比较明显多于对照组，而移植丹参组的卵泡存活率高于移植对照组，说明丹参可能有助于减少移植卵巢卵泡的丢失，提高卵泡生存率。 3、移植丹参组3个时间段回收卵巢组织中的SOD-mRNA基因表达均高于对照组，而iNOS-mRNA基因的表达低于对照组，提示丹参可能通过上调SOD-mRNA的表达，清除氧自由基，下调iNOS-mRNA的表达，抑制NO过度产生。 综上所述，丹参注射液可能通过上调SOD-mRNA的表达，抑制iNOS-mRNA的表达而改善冻融小鼠卵巢同种异体移植缺血缺氧性损伤、减少原始卵泡的凋亡，从而提高卵泡的存活率。