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摘要目的：G-蛋白偶联受体家族成员的第三胞内环被认为是受体与G蛋白相互作用的部位。本实验旨在构建表达人多巴胺D1受体（DRD1）的真核细胞表达载体，并在此基础上研究位于DRD1第三胞内环的229位氨基酸多态性（Ala229Thr）对于受体信号转导的影响。 方法：利用定点突变-基因重组技术构建含有不同基因型DRD1的真核细胞表达载体。从人基因组经聚合酶链式反应（PCR）克隆DRD1基因编码区全长。将纯化后的PCR产物与pMD19-T载体进行T连接，得到野生型重组克隆载体。在野生型重组克隆载体的基础上，应用定点突变方法构建突变型重组克隆载体。用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切野生型和突变型重组克隆载体，将酶切后得到的目的片段纯化后与经相同双酶切的pcDNA3.1（+）表达载体连接，即得到野生型和突变型DRD1-pcDNA3.1（+）重组真核细胞表达载体。将pcDNA3.1（+）空载体、野生型和突变型DRD1-pcDNA3.1（+）重组真核细胞表达载体分别瞬时转染入COS-7细胞，于转染后48小时，分别用100μM forskolin和不同浓度的DRD1激动剂（多巴胺和（±）-SKF38393）短时间处理细胞，用cAMP ELISA试剂盒检测细胞内cAMP水平。 结果：经酶切和测序证实野生型和突变型DRD1-pcDNA3.1（+）重组真核细胞表达载体构建正确。瞬时转染后48小时，cAMP ELISA试剂盒检测结果表明：在forskolin处理的情况下，空载体组和阴性对照组细胞内cAMP水平分别为0.40±0.14和0.78±0.24（pmol/well），两者之间无显著差异（P=0.082），野生型组和突变型组细胞内cAMP水平分别为2.06±0.35和1.37±0.12（pmol/well），野生型组细胞内cAMP水平显著高于空载体组（P<0.001）和突变型组（P=0.007）；在激动剂处理的情况下，细胞内cAMP水平均呈浓度依赖性升高，突变型组细胞内cAMP水平显著低于野生型组（多巴胺，P<0.001； SKF38393，P<0.001）。此外，我们还通过测定细胞内cAMP最高水平和计算EC50值来评价受体变异对激动剂效能和效价的影响。结果显示：受体变异使激动剂诱导的细胞内cAMP最高水平显著降低（多巴胺，P<0.001； SKF38393，P<0.O01）。多巴胺的EC50值在野生型组为568.87±54.02nM，突变型组为9590.00±83.14nM，比野生型组增加16倍，两者之间存在显著差异（P<0.001）； SKF38393的EC50值在野生型组为406.13±15.75nM，突变型组为408.63±42.46nM，两者之间不存在明显差异（P=0.928）。 结论：成功构建野生型和突变型DRD1-pcDNA3.1（+）重组真核细胞表达载体；DRD1 Ala229Thr多态性影响受体的激活和信号转导，受体变异后可显著降低其信号转导。