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摘要目的：①比较不同玻璃化冷冻方案对小鼠卵巢组织的影响，为人类卵巢组织玻璃化冷冻方案的选择提供实验依据和理论基础。②观察不同的蔗糖浓度对玻璃化冻存小鼠卵巢组织的影响。③研究Caspase抑制剂z-DEVD-fmk对玻璃化冻融小鼠卵巢组织的影响。④通过检测卵泡颗粒细胞冻融后Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3表达的变化，来揭示卵泡颗粒细胞在冻融过程中其Caspase激活的途径。 方法：⑴将80只小鼠的卵巢进行玻璃化冷冻，根据不同的冷冻保护剂组合[I:200/0(v/v) EG+20％(v/v) DMSO，II:20％(v/v)EG+20％(v/v)PROH，III:20％(v/v) PROH+20％(v/v)DMSO]和平衡时间(a:15分钟，b：30分钟，c：45分钟)，将实验组的小鼠随机分为9组，新鲜的和冻融后的卵巢皮质分别进行光学显微镜观察、TUNEL实验和免疫组织化学分析。⑵60只小鼠被随机分为新鲜对照组和实验组，实验组进行玻璃化冻融。根据不同的蔗糖浓度，实验组分为I组(0.2 M蔗糖)、II组(0.4 M蔗糖)、III组(0.8 M蔗糖)和Ⅳ组(1.6 M蔗糖)。移植术后进行阴道细胞涂片检查，移植术后1个月测血清雌二醇和卵巢移植物卵泡密度。⑶将30只小鼠随机分为三组：A组(新鲜对照组)、B组(添加z-DEVD-fmk组)和C组(未添加z-DEVD-fmk组)，B组和C组的卵巢组织进行玻璃化冷冻，一部分卵巢皮质组织进行组织学分析，另一部分卵巢皮质组织进行自体移植，手术后一个月后测血清雌二醇浓度和卵巢移植物的增殖细胞核抗原表达率。⑷将小鼠分为新鲜对照组和实验组。实验组进行玻璃化冻-融。新鲜对照组分为A组(颗粒细胞来自新鲜的卵巢组织)和C组(新鲜卵巢组织的颗粒细胞、体外培养2小时)。实验组分为B组(颗粒细胞来自冻融后卵巢组织)和D组(冻融后的组织的颗粒细胞、体外培养2小时)。应用RT-PCR和Western-blot检测卵泡颗粒细胞Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表达情况。 结果：㈠光镜观察发现各实验组的始基卵泡形态正常率和窦前卵泡形态正常率均明显低于对照组，IIb组的始基卵泡形态正常率和窦前卵泡形态正常率均高于其它实验组，差异有统计学意义。IIb组卵泡凋亡率和Bax蛋白阳性表达率低于其它实验组，差异具有统计学意义。②本实验发现II组(0.4M蔗糖)和III组(0.8M蔗糖)的小鼠出现动情周期的天数少于I组(0.2M蔗糖)和IV组(1.2M蔗糖)的小鼠出现动情周期的天数，差别具有统计学意义，而II组(0.4M蔗糖)和III组(0.8M蔗糖)之间的差别无统计学意义。另外，II组(0.4M蔗糖)和III组(0.8M蔗糖)的小鼠血清雌二醇浓度和卵巢移植物的卵泡密度高于I组(0.2M蔗糖)和IV组(1.2M蔗糖)的小鼠血清雌二醇浓度和移植物的卵泡密度，差别具有统计学意义，而II组(0.4M蔗糖)和III组(0.8M蔗糖)之间的差别无统计学意义。③光镜观察发现冷冻组的始基卵泡和窦前卵泡的形态正常率均明显低于对照组，B组的始基卵泡和窦前卵泡的形态正常率与C组比较无明显差异。然而，B组血清雌二醇浓度高于C组，差异有统计学意义。C组窦前卵泡的超微结构改变较B组的改变明显，同样，B组移植物卵细胞和间质细胞PCNA蛋白表达率高于C组。④与新鲜的颗粒细胞相比，冻融后的颗粒细胞的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表达显著上升，差异均具有统计学意义。结果还显示：体外培养2小时后的冻融的卵巢颗粒细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达水平均较未培养的冻融后卵巢颗粒细胞的高，差异均具有统计学意义。 结论：⑴IIb方案(EG与PROH的组合，室温下平衡时间30分钟)是适合于小鼠卵巢组织(皮质切片，体积1 mm3)的玻璃化冷冻方案。⑵0.4M或0.8M是适合于玻璃化冻存小鼠卵巢组织的蔗糖浓度。⑶Caspase抑制剂z-DEVD-fmk在卵巢组织冻融过程中具有保护作用。⑷卵巢颗粒细胞凋亡是卵巢颗粒细胞冻-融损伤的重要机制，线粒体通路和死亡受体通路同时参与了对卵巢颗粒细胞在冻-融过程中凋亡的调控。凋亡的发生不是瞬间的，其完成是一个至少需要几小时的过程。