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摘要脑卒中是神经系统的常见疾病和多发疾病，在各个年龄阶段均可发生，具有高发病率，高致残率，高死亡率的特点。然而，对缺血性脑血管病，目前尚缺乏直接有效的措施，治疗也多是针对并发症，一旦发生，多难以逆转。揭示这类疾病的分子机制，寻找防治和减轻缺血性脑损伤的有效措施，开发预防和治疗缺血性脑血管病的有效药物，都有着十分重要的医学价值和社会意义。一氧化氮(NO)是机体内的重要信使分子和效应分子，为维持神经传递，血管舒张的内源性介质，与神经系统的生理状况和病理过程密切相关。在应激状态下，继发多种信号通路的激活，其中JNKs通路在缺血性脑损伤中起着重要的作用。本课题主要目的是：通过研究一氧化氮外源性供体硝普钠和一氧化氮合酶抑制剂7-NI和AMT对急性脑缺血/再灌注后海马神经元的保护作用及其与JNKs通路相互作用的关系，探讨一氧化氮在急性脑缺血/再灌注中的作用及其机制。 本课题分三部分组成： 第一部分：急性脑缺血/再灌注模型的制备及JNKs通路的表达活化规律 1.制备SD大鼠四动脉结扎急性全脑缺血模型，用免疫印迹方法检测缺血0分钟、5分钟、15分钟、30分钟海马胞浆中JNKs通路的活化情况：急性脑缺血5分钟JNKs通路即被迅速激活，在缺血15分钟，p-JNKs的异常活化达到高峰，在此过程中，JNKs表达未见明显变化：用免疫组化方法检测脑缺血时海马神经元内p-JNKs亚细胞定位情况：在急性脑缺血时，p-JNKs表达从胞浆转移至细胞核，存在核移位。 2.采用SD大鼠四动脉结扎急性全脑缺血/再灌注模型，缺血15分钟再灌注0分钟、30分钟、3小时、6小时、12小时、1天、3天，在规定时间点断头取海马，用免疫印迹方法检测海马胞浆中JNKs通路活化情况：在脑缺血/再灌注中，胞浆中JNKs被迅速异常激活，于再灌注30分钟和3天，p-JNKs的异常表达存在两个高峰；于再灌注6小时，胞核中c-Jun的异常磷酸化存在高峰；于再灌注24小时，海马胞浆中Caspase-3的活化存在高峰。于再灌注第五天，行4％多聚甲醛灌注，取脑行尼氏染色，观察海马CA1区神经元存活情况：缺血/再灌注组存活神经元数较假手术组存活神经元数明显降低，脑缺血诱发神经元死亡，两者存在显著差异。结果提示：急性脑缺血/再灌注可以导致海马神经元死亡，在此过程中，有JNKs通路的异常活化。 第二部分：一氧化氮供体硝普钠对急性脑缺血/再灌注中海马神经元损伤的保护作用研究 将SD大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注组、单次硝普钠给药组、7天连续硝普钠给药组、生理盐水对照组：于再灌注30分钟、6小时、24小时、3天断头取海马，用免疫印迹方法检测海马中JNKs通路的变化情况：单次硝普钠给药组能降低再灌注30分钟胞浆中p-JNKs峰值，对再灌注3天p-JNKs的峰值无明显影响；能降低再灌注6小时胞核中c-Jun的磷酸化峰值；能降低再灌注24小时Caspase-3的活化峰值。7天连续硝普钠给药组能降低再灌注30分钟和3天海马胞浆中p-JNKs峰值；能降低再灌注6小时胞核中c-Jun的磷酸化峰值；能降低再灌注24小时Caspase-3的活化峰值；生理盐水对脑缺血/再灌注JNKs通路无明显影响。于再灌注第五天，行4％多聚甲醛灌注，取脑行尼氏染色，观察海马CA1区神经元存活情况：与缺血/再灌注组相比，单次硝普钠给药组对脑缺血/再灌注导致的海马神经元损伤未见明显保护作用，7天连续硝普钠给药组对脑缺血/再灌注导致的海马神经元损伤具有明显的保护作用，生理盐水给药组对脑缺血/再灌注导致的海马神经元损伤无保护作用。结果提示：急性脑缺血/再灌注中，外源性一氧化氮供体硝普钠能够降低JNKs通路的表达，7天连续硝普钠给药组对海马神经元具有明显的保护作用。 第三部分：一氧化氮合酶抑制剂7-NI和AMT对急性脑缺血/再灌注中海马神经元损伤的保护作用研究 将SD鼠随机分为假手术组，缺血/再灌注组，7-NI给药组，AMT给药组，生理盐水对照组，1％DMSO对照组；于再灌注30分钟、6小时、24小时、3天断头取海马，用免疫印迹方法检测海马中JNKs通路的变化情况：7-NI给药组能降低再灌注30分钟胞浆中p-JNKs峰值，对再灌注3天胞浆中p-JNKs的峰值无明显影响；能降低再灌注6小时胞核中c-Jun的磷酸化峰值；能降低再灌注24小时Caspase-3的活化峰值；AMT给药组对再灌注30分钟胞浆中p-JNKs的峰值无明显影响，能降低再灌注3天胞浆中p-JNKs的峰值；能降低再灌注6小时胞核中c-Jum的磷酸化峰值；能降低再灌注24小时Caspase-3的活化峰值；1％DMSO对照组对脑缺血/再灌注JNKs通路无明显影响。于再灌注第五天，行4％多聚甲醛灌注，取脑行尼氏染色，观察海马CA1区神经元存活情况：与缺血/再灌注组相比，7-NI给药组对脑缺血/再灌注导致的海马神经元损伤具有保护作用；AMT给药组对脑缺血/再灌注导致的海马神经元损伤具有明显的保护作用，保护作用强于7-NI给药组；生理盐水对照组和1％DMSO对照组对脑缺血/再灌注导致的海马神经元损伤无保护作用。结果提示：在脑缺血/再灌注中，一氧化氮合酶抑制剂7-NI和AMT均能降低JNKs通路表达，两者均对海马神经元具有保护作用，iNOS抑制剂AMT保护作用强于nNOS抑制剂。 综上所述：急性脑缺血/再灌注中，存在JNKs通路的异常活化，J-NKs通过位于下游的c-Jun和Caspase-3的活化而导致海马神经元损伤。J-NKs通路的活化过程中与NO有关，外源性NO对脑缺血/再灌注导致的神经元损伤具有保护作用；内源性NO对脑缺血/再灌注过程中神经元具有损害作用，iNOS产生的NO的损害作用强于nNOS产生的NO的损害作用。对JNKs通路的深入理解有利于在脑缺血治疗中确立合适的靶点及制定相应的干预措施。