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摘要背景及目的： 胃癌是指来源于胃粘膜上皮和腺上皮的恶性肿瘤，在胃的恶性肿瘤中胃癌约占95%。胃癌是人类常见的恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤的发病率中占第二位，是严重危害人类生命健康的恶性疾病之一。同其他肿瘤一样，胃癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程，是多种改变在细胞内累积，从量变到质变的过程。Correa总结了胃癌流行病病因学的研究结果，提出人肠型胃癌的发生模式：正常胃粘膜-慢性浅表性胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-早期癌-进展期癌。胃粘膜肠上皮化生（又称肠化生）是指胃粘膜上皮及腺上皮在病理情况下转变为肠粘膜上皮及腺上皮。胃粘膜肠上皮化生是胃癌发生过程中重要的步骤。 胃粘膜肠上皮化生向胃癌进展的过程与多种基因有关。尾型同源异形盒基因CDX2（caudaltypehomeoboxgene2）属于同源盒基因（homeoboxgenes，Hoxgenes）家族中一员，最早是由Mlodzik于果蝇中分离成功，它是肠道特异性转录因子，在胚胎发育中其表达产物广泛存在于胚胎消化道腺上皮中，对于后部体节和消化道的形成、发育和成熟起重要作用，在出生后，正常情况下在胃粘膜上皮中不表达，广泛表达于小肠及结肠粘膜，对肠上皮的分化以及形态和功能的维持也具有决定性的意义。有研究显示CDX2在慢性萎缩性胃炎相关的肠上皮化生中高表达并在部分胃癌中表达，表明其有可能与胃粘膜向肠上皮转化及胃粘膜癌变发生有关。 现代分子生物学认为，遗传学和表观遗传学共同调控生物信息的表达，遗传信息提供了“生产”所必需蛋白质的“蓝本”，而表观遗传学则指示细胞怎样、何时和何地表达这些信息。表观遗传学是指在不影响基因序列的情况下由DNA的甲基化/去甲基化及组蛋白的乙酰化/去乙酰化不同状态引起基因的表达改变。DNA甲基化指由DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferases，DNMTs）介导，在CpG二核苷酸胞嘧啶5位碳原子上加入一甲基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化学反应，生物学功能主要表现为在序列不变的情况下，控制基因表达，维护染色体的完整性和调节重组及某些特定基因组区域的转录活性。与突变等遗传学基因异常不同的是，抑癌基因的高甲基化状态是可逆的，应用甲基转移酶抑制剂将处于甲基化状态的基因进行去甲基化激活，可以恢复某些关键性抑癌基因的功能而起到预防和治疗肿瘤的作用，为我们进一步研究去甲基化试剂抗肿瘤提供了很好的依据，所以抑癌基因的甲基化研究不仅对恶性肿瘤的病因、早期诊断及预后评价有很大价值，而且对肿瘤的基因治疗研究有着不可替代的作用。 目前，有关CDX2在胃癌、大肠癌、食管癌等肿瘤中的异常甲基化也有报道，并推测其与肿瘤的治疗、预后有关。但目前对胃粘膜肠上皮化生中的CDX2基因CpG岛甲基化状态的研究较少。本研究通过检测CDX2基因在不同亚型肠上皮化生和胃癌中的表达和甲基化状态，及其与临床特点的关系，初步探讨了CDX2在肠上皮化生向胃癌转变过程中的作用及机制。内容包括： 1．CDX2在肠上皮化生和胃癌中的蛋白表达； 2．CDX2在肠上皮化生和胃癌中的启动子甲基化状态； 3．5-aza-CdR对人胃癌细胞KATO-Ⅲ和AGS中CDX2mRNA表达和启动子甲基化状态的影响。 材料和方法： （一）材料 1．2008年3月至2008年7月期间于南方医院消化内镜中心因上腹部不适、早饱、嗳气等症状行胃镜检查并病理诊断肠上皮化生患者53例，其中男37例，女16例，年龄35-74岁，平均57岁。另取18例无主观症状且病理检查排除IM及胃癌的健康检查者胃粘膜。每例均于距幽门口1-2cm处活组织检查。胃癌组织来自于同时期南方医院手术切除组织。所有标本均于离体后20min内获取，一部分制作蜡块，另一部分液氮速冻，然后放置于-80℃保存。所有患者均无已知严重的心脏、肝肾功能不全以及精神病史，胃癌患者手术前未接受化疗或放射治疗。所有患者均知情同意。 2．人胃癌细胞株KATO-Ⅲ和AGS，来自于ATCC。 （二）方法 1．运用高铁二铵-爱先蓝-过碘酸雪夫反应（HID-AB-PAS）将肠上皮化生分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，按照Lauren's分型将胃癌分为肠型和弥漫型； 2．运用免疫组织化学方法检测组织中CDX2蛋白表达情况； 3．采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测组织中CDX2启动子甲基化状态。 4．RT-PCR和MSP分别检测5-aza-CdR处理前后两种胃癌细胞中CDX2mRNA表达和启动子甲基化状态。 （三）统计学分析 实验数据采用SPSS13．0软件包的X2检验和方差分析等检验方法进行统计学分析。 结果： （一）基本情况：正常胃粘膜18例，肠上皮化生53例，包括Ⅰ型22例，Ⅱ型18例，Ⅲ型13例。胃癌36例，包括肠型胃癌21例，弥漫型胃癌15例。 （二）CDX2的表达情况 1．CDX2在正常胃粘膜中不表达。不同亚型肠上皮化生中CDX2表达阳性率（分别为Ⅰ型95．5%，Ⅱ型83．3%，Ⅲ型61．5%）有显著差异（P=0．036），呈逐渐降低趋势。胃癌中CDX2的阳性表达率（52．8%）显著低于肠上皮化生（83．0%）（P=0．002），且与胃癌的组织学类型有关，肠型胃癌中CDX2阳性表达率（71．4%）显著高于弥漫型胃癌（26．7%）（P=0．008）。 2．肠上皮化生和胃癌病例中CDX2表达均主要集中于H．pylori感染阴性者，肠上皮化生中两者列联系数C=0．267，P=0．067，胃癌组织中两者列联系数为C=0．121，P=0．463，H．pylori感染对CDX2表达无影响。 3．胃癌中CDX2表达与年龄、性别无关；无淋巴结转移组CDX2阳性表达率（100．0%）显著高于淋巴结转移组（43．3%）（列联系数C=0．390，P=0．020），但两者关系不密切；CDX2与浸润深度的列联系数C=0．317，P=0．106，提示肿瘤浸润深度与CDX2表达不相关。 （三）CDX2启动子甲基化状态 1．正常胃粘膜全部表现出CDX2启动子甲基化，肠上皮化生中CDX2启动子甲基化率为43．4%，（其中Ⅰ型22．7%，Ⅱ型55．6%，Ⅲ型61．5%），显著低于胃癌中CDX2启动子甲基化率（69．4%）（P=0．016），不同亚型肠上皮化生中CDX2启动子甲基化率也有显著性差异（P=0．036）。CDX2启动子甲基化率在肠型胃癌中（66．7%，14/21）低于弥漫型（73．3%，11/15），但两者无统计学差异（P>0．05）。 2．胃癌中无淋巴结转移组CDX2启动子甲基化率（50．0%）低于淋巴结转移组（73．3%）（列联系数C=0．185，P=0．343），但差异无统计学意义；CDX2启动子甲基化状态与浸润深度的列联系数C=0．323，P=0．041，提示肿瘤浸润深度与CDX2启动子甲基化状态有关，且浸润越深，甲基化率越高，两者的关系不密切。 3．肠上皮化生中CDX2启动子甲基化病例中CDX2表达阳性率（36．4%）显著低于非甲基化病例（列联系数C=0．299，P=0．031），胃癌中CDX2启动子甲基化病例中CDX2表达阳性率（47．4%）亦显著低于非甲基化病例（94．1%）（列联系数C=0．452，P=0．002），CDX2启动子甲基化可导致CDX2表达减少。 （四）未经5-aza-CdR去甲基化处理的胃癌细胞AGS内发现CDX2mRNA的表达，启动子为非甲基化；而KATO-Ⅲ细胞内未发现CDX2mRNA的表达，启动子为甲基化。经过5-aza-CdR药物行去甲基化处理后KATO-Ⅲ细胞内CDX2mRNA得到重新表达，启动子则转变为非甲基化。 结论： （一）CDX2在肠上皮化生向胃癌的转化过程中呈逐渐降低趋势，可能起着抑制癌基因作用； （二）CDX2启动子甲基化是导致CDX2表达缺失的主要机制，表观遗传学机制是胃癌发生的重要分子机制。 （三）5-aza-CdR能通过使CDX2启动子去甲基化而使胃癌细胞KATO-Ⅲ中CDX2mRNA再次表达，CDX2基因启动子甲基化是使该基因失活的重要原因，去甲基化后该基因得到重新表达。通过药物或其他手段对CDX2基因甲基化状态进行调控达到对胃癌发生的抑制作用，从而有望在胃癌临床治疗上提供新思路。