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摘要急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是一种多系统疾病，是临床常见急腹症之一，不但累及胰腺，而且累及肝、肺、肾脏等器官，早期死亡的主要原因是AP合并多器官功能衰竭，其住院病人死亡率高达25%。由于胰腺血液在回流心脏前需经过肝脏的代谢和处理，而肝脏的Kupffer细胞（Kupffercell，KC）占整个单核巨噬细胞系统的80%～90%，是体内最大的固定巨噬细胞群，因此肝脏是AP最常累及的胰外器官之一，其对AP的病情发展也有重要影响。而且，肝功能损害已被认为是判断AP严重程度的重要指标，已作为独立的指标合并进了预测AP严重程度的Ranson评分和急性生理慢性健康评估Ⅱ（Acute Physiological Chronic Health EvaluationⅡ，APACHE Ⅱ）系统，对预测AP临床预后尤为重要。 关于AP时并发多器官功能不全综合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的发病机制存在众多理论，除胰酶异常激活、微循环障碍、肠道细菌易位、内毒素血症及二次打击学说外，炎症介质过度表达理论目前已经成为又一研究难点及热点。许多研究表明炎症因子在AP的发生、发展中起着重要作用。在细胞水平，细胞因子的作用能被协同，拮抗或互补，表明在促炎和抗炎刺激下存在复杂的相互作用。AP时，胰腺腺泡细胞凋亡、胰酶大量释放，胰酶及胰腺坏死产物迅速诱导氧自由基释放，活化核因子-kappaB（NF-kB），并随之产生大量促炎细胞因子如TNF-α，IL-1，IL-6及IL-18等，引起细胞黏附分子上调和白细胞活化以及许多其他递质爆发等一系列连锁和放大反应，这些细胞因子的大量释放，各种效应细胞活化，最终导致全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）以及MODS。 JAK/STAT（Janus Kinases/signal transducers and activators of transcription）信号通路途径最初是在1994年，Darnell等进行干扰素（IFN-α和IFN-γ）对细胞的作用机制研究时发现的，它代表的是一条极其快速的从细胞外到细胞核的信号转导通路，环节少而简洁。多种细胞因子可与细胞表面受体结合，诱导受体二聚化，并通过酪氨酸磷酸化作用激活JAK，活化的JAKS可使受体的酪氨酸结合位点磷酸化，当细胞受到信号刺激时，SH2结构域与受体上磷酸化的酪氨酸残基相结合，磷酸化的STATS从受体上解离下来进入核内，与DNA靶序列特异性结合，调节相应基因表达，完成细胞因子介导的信号转导全过程。近年来有有研究表明，JAK/STAT信号通路参与了多种重要致炎、抗炎细胞因子的信号转导及调控过程，尤其以IFN-r、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10以及近年新发现的促炎症因子IL-18与JAK/STAT信号通路活化关系密切。业已明确，IFN-r是脓毒症时重要的炎症介质，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）合并IFN-r攻击时小鼠致死率明显升高，其原因可能与IFN-r活化JAK/STAT信号通路有关。然而，关于JAK/STAT信号通路在AP大鼠肝脏KC分泌促炎性因子中的作用，目前尚无研究报道。 基于此，本研究将通过体外实验建立AP模型，利用ELISA、细胞免疫荧光技术、Western blot等技术研究实验性AP大鼠肝脏KC中JAK/STAT活化、TNF-α、IL-6及IL-18的表达，并通过JAK2特异性抑制剂AG490进行干预性研究，选择性地阻断JAK从而阻断JAK/STAT信号转导阐明JAK/STAT信号通路、细胞因子网络之间的相互作用关系及调控机制，以从分子水平阐明AP肝损伤的发病机制，为AP临床治疗提供一个新的思路。 目的: 以AP肝损伤作为研究对象，通过原代细胞培养对肝脏KC表达的炎症细胞因子在JAK2/STAT信号通路中的作用，以及JAK2抑制剂对AP肝损伤的保护作用，以期对AP病程中胰外器官损伤发生率高、病死率高的原因，及其与SIRS之间的相互关系进行初步探讨，为临床最终达到提高AP疗效、减少AP并发症、降低其病死率提供理论和实验依据。 材料和方法: 健康雄性SD大鼠24只（200～250g），购自南京军区总医院实验动物中心。本实验按采用改进了的酶消化、密度梯度离心以及选择贴壁法提取KC。将提取的KC接种于6孔板中（1×10/ml），1h后去除培养基，再用温PBS清洗2遍，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所需的高纯度的KC，继续用10%FCS的RPMI-1640培养基继续培养24h后，按随机数字表随机分成细4组，A组：在培养基上清液中加入生理盐水（30ul/ml）作为正常对照组；B组：上清液LPS（50ng/ml）处理组；C组：LPS（50ng/ml）和elastase（1U/ml）处理组；D组：AG490预处理组：AG490（30nmol/ml）预先刺激0.5h后，再用LPS（50ng/ml）和elastase（1U/ml）处理，每组设4个复孔。各组细胞置于相同条件下培养，12h后收集培养基，4℃，10000×g离心10min，取上清液并立即冻于-70℃保存；同时收集KC，提取蛋白并定量。分别用ELISA试剂盒检测细胞上清液IL-6、IL-18和TNF-α含量和用细胞免疫荧光技术和Western blotting法检测细胞总蛋白中JAK2的表达情况。 本研究所有计量资料以均数士标准差（x±s）表示，数据统计分析使用SPSS13.0软件，计量资料采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.A、B、C、D四组总的比较，差异有统计学差异（P=0.000）。与A组比较，B组TNF-α，IL-6和IL-18含量均显著增加，差异有统计学差异（P=0.000）；与B组比较，C组TNF-α，IL-6和IL-18含量均显著增加，差异有统计学差异（P=0.000）；与C组比较，D组TNF-α，IL-6和IL-18含量显著降低，差异有统计学差异（P=0.000），但与B组比较仅有轻微变化，差异均无统计学差异（P>0.05）。 2.荧光显微镜下观察细胞发绿色荧光情况。未作处理的KC未检测到荧光染色的细胞；B组可见JAK2表达微弱；给与LPS和elastase处理后，JAK2表达上调；D组给与AG490预处理后，JAK2表达明显下调。 3.各实验组和对照组KC中均有JAK2表达。A、B、C、D四组总的比较，差异有统计学差异（P=0.000）。给与LPS刺激后，JAK2含量与对照组比较增加，差异有统计学差异（P=0.000）；同时给予LPS和elastase刺激后，与B组相比较JAK2含量增加，差异有统计学差异（P=0.000）；给予AG490预处理后，JAK2含量与C组比较减少，差异有统计学差异（P=0.000），但与B组比较仅有轻微变化，差异无统计学差异（P=0.928）。 主要结论: 1.AP病程中，KC在炎症反应放大、胰外器官损伤中起着重要的作用。 2.KC受到胰弹性蛋白酶等胰酶及LPS的刺激后诱导炎症因子的大量表达，激活JAK2/STAT信号通路，在炎症反应的发生、发展过程中发挥着重要作用，可能是导致SIRS和高MODS发生率、高病死率的原因。 3.胰弹性蛋白酶等胰酶刺激KC后，IL-6、IL-18和TNF-α等炎症因子的表达显著增加，这表明AP病程中炎症反应较其它疾病更易被异常放大的原因可能与胰弹性蛋白酶等胰酶的存在和大量释放有关。 4.AG490可显著减少胰弹性蛋白酶等胰酶及LPS的刺激后诱导的炎症因子的产生，其可能是通过抑制JAK2的活化，有效阻断其下游信号转导和转导激活子STAT的活化，进而抑制细胞因子介导的生理、病理效应，从而达到保护作用，提示针对KC在炎症反应中相关信号通路的抑制治疗，有望成为控制AP发生、发展及发现保护肝脏的新靶点。