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摘要血栓性疾病正严重威胁着人类的健康，而血栓形成机理和防治的研究是医学科学领域重大课题之一。在血栓形成过程中血小板发挥着至关重要的作用，而vonWillebrand因子（VWF）在血栓（尤且是动脉血栓）形成过程中发挥着关键的作用。VWF是由血小板、内皮细胞合成的大分子量的具有粘附功能的糖蛋白，在血栓形成过程中发挥着重要作用，它既可与血小板膜糖蛋白（GP）Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ、GPⅡb/Ⅲa结合，又可以和胶原结合介导血小板粘附聚集于受损的血管内皮下组织，导致血栓形成。在此过程中胶原—VWF—GPⅠb间的相互作用是血小板活化的早期事件，VWF是血小板与血管壁胶原之间的桥梁分子，因此阻断VWF在此过程中的作用，可以有效地抑制血栓形成。 本文根据胶原—VWF—GPⅠb轴相互作用的关系，针对GPⅠbα、VWF和胶原分子进行三部分研究。（1）首先，将与VWF A1区结合的重组GPⅠbα活性片段H1—V289（rGPⅠb H1—V289）和与胶原结合的VWF—A3区基因片段分别在CHO细胞和大肠杆菌细胞中表达及其生物学活性研究；（2）然后，用rVWF A3为抗原免疫Balb/c小鼠，经标准单克隆抗体技术制备和鉴定了两株VWF A3区单抗SZ—123和SZ—125；（3）最后，对SZ—123和S2—125抑制VWF—胶原和VWF—GPⅠbα相互作用和抑制血小板在Ⅲ型胶原上粘附功能作进一步研究。试图进一步阐明VWFA1和A3区相互作用关系和VWF构象和功能调节关系提供理论依据，同时期望获得性能优越的抗栓制剂，对预防和治疗血栓性疾病具有重要的意义。 一、重组糖蛋白Ibα活性片段H1—V289和VWF A3区的表达和功能研究 血小板上GPⅠbα是血栓形成过程中的的一个重要糖蛋白，在初期止血阶段发挥着重要作用。GPIbα氨基末端分子量45KD片段（H1—V289）既是VWF A1区结合部位，又是凝血酶结合部位。因此建立表达重组糖蛋白Ibα活性片段（rGPⅠbαH1—V289）细胞株，对于研究GPⅠb—VWF—Collagen轴心中各成分之间相互作用的机理和抗栓药物的研究具有重大的理论和应用价值。我们利用脂质体将含有编码GPⅠbα H1—V289 DNA质粒pCMV3转染CHO细胞，用SZ—2—溴化氰活化的—Sepharose4B亲和层析法纯化重组片段，用SDS—PAGE和Western—blot鉴定纯化产品的纯度和免疫学活性。用血小板聚集法检测纯化产品对瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能的影响。用ELISA测定纯化产品对VWF与血小板结合能力的影响。结果是每1L培养上清液可纯化到6.15mg rGPIbα H1—V289重组产品。SDS—PAGE显示，纯化的重组片段主要在42KD处显一蛋白区带，Western—blot显示，抗GPⅠbα单抗SZ—2能与重组片段在42KD处显单一蛋白区带。纯化重组片段能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能。ELISA测定显示纯化产品抑制血浆VWF与血小板的结合能力。因此我们获得的CHO细胞株能恒定表达rGPⅠbα H1—V289，重组片段具有较高的纯度、免疫学活性和生物学活性，有可能开发为有效的抗血栓药物和进行科学研究。 VWF—A3区是胶原的主要结合部位。我们应用RT—PCR方法从人脐静脉内皮细胞中克隆VWF—A3区基因片段。测序证明克隆的基因序列完全正确，然后构建了表达载体pET—20b—VWF—A3，在大肠杆菌中进行诱导表达，所表达的目的蛋白为菌体总蛋白的46.7%。经次氮基三乙酸镍琼脂糖（Ni—NTA agarose）柱纯化后，目的蛋白的纯度在95%以上。大肠杆菌中高效表达的重组VWF—A3蛋白（rVWF—A3）复性后，应用胶原结合试验分析rVWF—A3蛋白的生物学活性。rVWF—A3与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原均有结合活性。结果表明rVWF—A3具有较高的纯度和良好的生物学功能，可作为免疫原免疫Balb/C小鼠，制备抗VWF A3区的单抗。 二、VWF A3区特异性单抗SZ—123和SZ—125研制和鉴定 自从抗GPⅡb/Ⅲa单克隆抗体7E3获得FDA批准应用于缺血性心脏患者的临床治疗、PTCA术后再梗塞的预防，取得了满意的疗效，抗血栓抗体药物的研制已成为该领域的研究热点。但在GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂的治疗中，已报道若干副作用，包括出血、血小板减少等。因为VWF在血小板和胶原之间起到桥梁作用，而VWF A3区与胶原的结合是启动血小板粘附、聚集并进而导致血栓形成的首要环节，因此针对VWF与胶原结合区域A3区的抗体有可能具有抑制血小板的粘附、聚集和抗血栓形成的作用。本研究用大肠杆菌表达的rVWF—A3蛋白免疫Balb/C小鼠，经标准单克隆抗体技术制备单抗。用ELISA法鉴定单抗特异性，经VWF胶原结合抑制试验筛选获得抑制性单抗，用免疫印迹技术确定单抗与rVWF—A3和还原性人VWF识别的抗原分子。经胶原结合试验确定单抗对VWF与胶原结合的影响。结果共获得一组共30株抗VWF—A3区单抗，其中两株确定为抑制VWF与胶原结合的单抗，分别命名为SZ—123和SZ—125，两株单抗分别与rVWF—A3和VWF反应强烈，而不与重组VWF—A1区、A2区反应。Western—blot显示SZ—123和SZ—125分别识别分子量为27kDa的rVWF—A3区带和还原性人VWF的250KDa的VWF单体和170KDa的VWF酶切片段。因此SZ—123和SZ—125是抗VWF—A3区特异性单抗。 三、VWF A3区单抗SZ—123和SZ—125的功能研究 为了研究单抗SZ—123和SZ125生物学功能，我们首先探讨两株VWF—A3区单抗，SZ—123和SZ—125对VWF—胶原相互作用的影响。通过用胶原结合试验测定两株单抗对VWF与人胎盘或牛皮肤Ⅲ型胶原结合反应影响，同时测定了两株单抗对正常人、弥猴、Beagle犬、兔、大鼠和豚鼠的血浆VWF与Ⅲ型胶原结合反应的影响。结果显示单抗SZ—123和SZ—125剂量依赖性地抑制纯化的人VWF与人的Ⅲ型胶原结合（IC50=0.07±0.02和0.15±0.03μg/ml）和与牛皮肤Ⅲ型胶原结合（IC50=0.48±0.06和0.51±0.07μg/ml）。单抗SZ—123和SZ—125也抑制正常人、弥猴、Beagle犬血浆与Ⅲ型胶原结合反应，但不抑制兔、大鼠和豚鼠的血浆VWF与Ⅲ型胶原结合反应。因此单抗SZ—123和SZ—125是两株中和性抗VWF—A3区单抗，能抑制VWF—胶原相互作用，是VWF依赖的血小板黏附于胶原的有潜能的抑制剂，可成为具有治疗潜力的抗血栓药物。 然后，我们探讨SZ—123和SZ—125对VWF—GPⅠbα相互作用的影响。应用瑞斯托霉素、博托酶素、牛血浆、胶原和ADP为诱导剂进行血小板聚集试验。用ELISA测定了SZ—123和SZ—125对VWF与固相化的重组血小板GPIbα（H1—V298）活性片段或血小板结合的影响。血小板聚集试验显示SZ—123和SZ—125分别抑制瑞斯托霉素、博托酶素、牛血浆诱导的血小板聚集，而不抑制胶原或ADP诱导的人血小板聚集。SZ—123和SZ—125也抑制瑞斯托霉素诱导的VWF与固相化的重组血小板GPⅠbα活性片段（rGPⅠbα H1—V298）或血小板的结合。因此，单抗SZ—123和SZ—125不仅抑制VWF—胶原的相互作用，而且阻断VWF—血小板相互作用。另外，这两株单抗也可以帮助我们说明VWFA1和A3区之间的相互作用。我们认为单抗SZ—123和SZ—125结合到VWF A3环，调节A1区的构型和功能。 最后，我们探讨了SZ—123和SZ—125在高剪切力下对VWF依赖的血小板在胶原上的黏附作用影响。通过应用剪切力为1000S—1的Flow chamber试验，经肝素抗凝的人全血在已包被人胎盘或牛皮肤Ⅲ型胶原的小室中灌注，然后在显微镜下观察单抗SZ—123和SZ—125对血小板在胶原表面上粘附的影响。同时，在上述相同剪切力下观察单抗SZ—123和SZ—125对血小板在固相化VWF表面上粘附的影响。Flow chamber试验显示SZ—123和SZ—125分别抑制高剪切力下人血小板在人胎盘或牛皮肤Ⅲ型胶原上的粘附。SZ—123和SZ—125抑制人血小板粘附到人胎盘胶原上的IC50值分别是3.6±0.5μg/ml和10.3±4.8μg/ml，而粘附到牛皮肤胶原上的IC50值分别是3.1±0.6μg/ml和11.3±3.6μg/ml。有趣的是SZ—123和SZ—125不抑制高剪切力下人血小板在固相化VWF表面上的粘附。至于SZ—123和SZ—125如何调节VWF A1区功能，VWF A1和A3区的构型和功能之间的关系我们需要作进一步的研究和探讨。 总之，我们研制和鉴定了两株新型的VWF A3区特异性单抗SZ—123和SZ—125。SZ—123和SZ—125不仅抑制在静止和流动条件下VWF—胶原相互作用，而且抑制VWF—GPⅠbα相互作用，同时在高剪切力条件下也抑制VWF依赖的血小板黏附于Ⅲ胶原表面。我们的实验数据提示单抗SZ—123或SZ—125结合到VWF A3环后间接地调节VWF A1区的功能。我们正在评价单抗SZ—123和SZ—125潜在的抗血栓能力。