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摘要研究目的: 迄今为止的研究表明Treg细胞具有免疫负调节作用，TLR5的激活对某些损伤因素具有免疫保护作用，Treg细胞上TLR5/TLR7/8高表达，但是同种移植状态下，TLR5的活化状态和活化的调节及对Treg的影响途径、机理和信号传导途径尚不清楚。我们推测利用Flagellin刺激同种移植TLR5活化，可能在体内扩增Treg的比例，增强Foxp3的表达，从而达到形成移植耐受的目的。 本课题首先分析了同种皮肤移植急性排斥过程中TLR5和Foxp3基因的动态表达状况，然后应用Rapa和CsA两种不同的免疫抑制剂对小鼠同种皮肤移植模型进行耐受初步诱导，研究了Rapa和CsA体内应用对TLR5和Foxp3基因表达的影响及与移植物生存的关系；研究了Flagellin体外处理对移植耐受模型中T细胞及相关分子TLR5、Foxp3表达影响及与Rapa和CsA是否与协同作用；探讨了同种移植状态下TLR5表达的变化及意义，探讨TLR5和Foxp3表达的相关性，旨在阐明Rapa、CsA及Flagellin在同种移植耐受状态下，是否能够通过激活TLR5，增强Treg的活性，强化免疫耐受的诱导，为利用TLR5特异配体-Flagellin和抗排斥药物Rapa、CsA联合进行同种移植耐受诱导奠定实验基础，为CD4+CD25+ Treg体外扩增和应用于临床防治同种移植排斥反应探索新的途径。 实验方法: 1.Flagellin的提取和鉴定：利用LB营养培养基扩增甲型副伤寒杆菌，用PBS离心后洗涤按照文献[25]方法分离粗制鞭毛蛋白（Flagellin），然后通过Sephacryl S-200凝胶柱分离不同分子量的蛋白质，通过SDS-PAGE观察并收集目的蛋白（Flagellin），透析过夜，然后利用抗Flagellin抗体，通过Western Blot检测目的蛋白的特异性。纯化的Flagellin溶液经紫外分光光度仪测光密度OD260、OD280值，按照公式计算蛋白含量，置-20℃储存。 2.体内实验：以B6小鼠为供体，BABL/c小鼠为受体，建立小鼠同种皮肤移植模型。移植后第1天BABL/c小鼠分别给予Rapa（1.5mg/kg）或CsA（10mg/kg）及生理盐水腹腔注射进行耐受诱导，每日1次，连续14日。移植后第1、7、10、14、21天，分别取实验组及对照组小鼠脾脏及移植部位的皮片，采用异硫基氢酸胍（TRIzol）一步法提取细胞总RNA，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对转录产物进行扩增，以GAPDH作为对照，检测TLR5及Foxp3mRNA的相对表达量。 3.体外实验：分离纯化同种移植后第10天的小鼠脾T细胞，加入不同浓度的Flagellin处理3、6、12h后测定TLR5和Foxp3 mRNA的表达量，探讨Flagellin作用的最佳浓度及时间；进而在移植后第10天，提取耐受诱导的BABL/c小鼠脾细胞（术后第14天对照组移植皮片全部排斥）T细胞，经不同浓度Flagellin、Rapa、CsA体外处理后，RT-PCR检测TLR5及Foxp3 mRNA的相对表达量。同时选择未行移植术的正常BALB/c小鼠T细胞，经不同浓度Flagellin、Rapa、CsA体外处理后，检测TLR5及Foxp3 mRNA的相对表达量。 实验结果: 1.SDS-PAGE显示在分子量为52kD处有目的蛋白条带，Western Blot结果显示抗鞭毛抗体染色呈阳性。表明鞭毛蛋白提取成功。提取的蛋白浓度为75.03μg/ml。 2.与生理盐水对照组（12.8±1.6d）相比，同种移植后体内应用CsA（22.0±1.9d）或Rapa（23.8±2.ld）均可明显延长移植皮片的存活期（p<0.05）。Rapa处理组与CsA处理组相比，延长移植物存活的能力无明显差别，但Rapa处理组小鼠生存状态比CsA处理组更佳。 3.对照组同种移植后TLR5和Foxp3的表达均在排斥高峰期（移植后第10d）升高最明显，之后Foxp3的表达迅速下降，而TLR5的表达持续到移植后14d才开始下降。小鼠皮片急性移植排斥期1、7、10、14、21天，移植受体脾细胞的TLR5与Foxp3变化趋势明显正相关。 4.体内给予CsA后，TLR5和Foxp3的表达第7天就明显升高，第10天达到高峰，Foxp3在第14天恢复至起始水平，而TLR5在第21天恢复至起始水平；与对照组相比，在同种皮片移植后1、7、10、14、21天，Rapa体内处理组脾细胞TLR5 mRNA表达明显上调；TLR5表达量较CsA组和对照组明显增多，且停药后，第21天表达量仍明显高于CsA组和对照组。而Foxp3的表达的变化与CsA组无显著变化。 5.体外实验证明：1）Flagellin、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促进正常BABL/c小鼠T细胞的TLR5 mRNA明显高表达（p<0.05），其中Flagellin+Rapa联合处理组增高更明显，而单独用CsA处理组与未处理组相比无统计学差异。Flagellin处理组、Rapa组、Flagellin+Rapa联合处理组、Flagellin+CsA联合处理组的Foxp3 mRNA均明显高表达（p<0.05），其中Flagellin+Rapa联合处理组的变化最明显。单独使用CsA处理组与未处理组相比无统计学差异。2）经不同浓度Flagellin处理急性排斥期小鼠T细胞不同时间后发现，TLR5 mRNA在Flagellin浓度100ng/ml，培养6h表达最高。Foxp3mRNA在Flagellin浓度1000ng/ml，培养6h表达最高，且在所研究的各时间点，Flagellin均能促进Foxp3表达。3）Flagellin、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促进急性排斥期BABL/c小鼠T细胞的TLR5 mRNA表达，其中Flagellin+Rapa联合组增高更明显，而单独用CsA或Rapa处理组的TLR5 mRNA表达无显著改变。Flagellin、CsA、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA联合处理均可促进Foxp3 mRNA表达，其中Flagellin+Rapa联合处理组增高更明显。 结论: 1.体内应用Rapa或CsA均可明显延长同种移植皮片的存活时间，Rapa在抑制移植物排斥、改善宿主生存状态方面效果明显优于CsA。 2.同种移植急性排斥高峰期，TLR5和Foxp3表达升高，Rapa可以明显增强同种移植排斥期TLR5与Foxp3的表达，尤其是使Foxp3表达持续升高，CsA也可促进这两种基因的表达，但持续时间较短。 3.成功提取甲型副伤寒杆菌的鞭毛蛋白并进行了初步鉴定。 4.Rapa在体外可促进移植耐受模型T细胞的TLR5和Foxp3的基因表达，Flagellin可以协同增强Rapa这一作用。CsA可促进排斥高峰期T细胞Foxp3表达，但对TLR5表达无明显影响，与Flagellin无协同作用。Flagellin体外可以促进排斥高峰期T细胞TLR5和Foxp3的表达，并增强Rapa的作用效果。 5.Rapa和Flagellin体外均可促进正常小鼠脾T细胞的TLR5和Foxp3的表达，且相互具有协同作用。CsA对正常小鼠T细胞的TLR5和Foxp3的表达无明显作用。