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摘要肿瘤的干细胞起源学说最早可追溯到150多年前，但长久以来，由于实验技术缺陷，这一领域的研究未取得实质性进展。近10年来，干细胞研究的飞速发展和实验条件的成熟使得这一学说再次成为关注的焦点。目前，人们已从人急性髓系白血病、乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌等多种肿瘤中分离、鉴定出肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)，并发现它们可能是肿瘤发生、演进、转移和复发的根源(1-4)。 最近，研究发现胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)比其相应的分化型胶质瘤细胞高分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，且具有更强的诱导内皮细胞增殖、迁移及小管形成能力，缺氧可进一步上调GSCs VEGF分泌量(5)。我们的研究也发现GSCs高分泌VEGF和IL-8(interleukin-8)(6)，提示GSCs具有更强的促血管生成能力。此外，GSCs的运动、侵袭能力也强于分化瘤细胞。Yu an等在GSCs颅内移植瘤的边缘区及肿瘤与宿主脑组织的变界区内检测到大量GSCs(CD133+和nestin+细胞)(7)，同时Lee等也在肿瘤周围的正常脑组织中观察到大量nestin+/Sox2+细胞浸润(8)，提示GSCs比其相应的分化型胶质瘤细胞具有更强的侵袭能力。上述研究表明GSCs可能在胶质瘤血管生成和侵袭中发挥更加关键的作用。 新近，我们发现GSCs高表达功能性趋化因子受体CXCR4。因CXCR4在调控正常细胞和肿瘤细胞的增殖、生存、凋亡、迁移、侵袭、促血管生成中发挥重要作用，我们推测，CXCR4可能在胶质瘤促血管生成和侵袭中也发挥了重要作用。 CXCR4属于7次跨膜的G蛋白偶联受体家族成员，可被其配体CXCL12激活，进而使磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol3-kinase，PI3 K)-Akt通路、Ras-Raf-MEK-ERK通路、PLCγ-DAG-PKC通路和PLCγ-IP3-Ca2+通路活化。既往的研究发现PI3 K/Akt通路和Ras-Raf-MEK-ERK通路在正常和肿瘤的血管生成中尤其是促VEGF的分泌、迁移与侵袭中起着关键作用。CXCL12/CXCR4轴在不同细胞激活后通过其下游不同的信号通路参与细胞的生物学功能，是细胞依赖性的。在人乳腺癌细胞中CXCL12/CXCR4轴活化后通过激活其下游的PI3 K/Akt通路促进VEGF分泌参与肿瘤的血管生成(9)。而在不同的前列腺癌细胞系CXCL12/CXCR4轴激活后分别通过其下游PI3 K/Akt通路和MAPK/ERK通路促进分泌不同的血管生成因子(IO)。与此同时，在不同的细胞PI3 K/Akt通路和MAPK/ERK通路激活有的是通过其中的一条通路促进细胞的迁移侵袭(11-14)，有的则是两条通路共同参与该过程(15)。因此，研究何种通路在CXCR4介导的GSCs促侵袭和血管生成作用发挥效应至关重要。 本研究中，我们利用本课题组前期已建立的条件培养基筛选法(16)，从U87细胞系中获得胶质瘤细胞球，并运用免疫荧光染色检测其神经干细胞标记物CD133和nestin的表达。利用Western-Blot技术检测了CXCR4活化后，GSCs中PI3 K/Akt和MAPK/ERK通路的激活情况；运用ELISA法检测不同处理条件下GSCs培养上清中VEGF的分泌量；利用Transwell小室检测了不同处理条件下GSCs迁移和侵袭能力。主要结果和结论如下： 1.CXCL12刺激GSCs可引起PI3K/Akt通路和MAPK/ERK通路活化。免疫荧光染色显示，运用条件培养基筛选的胶质瘤细胞球表达神经干细胞标记物CD133和nestin。采用100 ng/ml CXCL12刺激后5 min可以检测p-Akt和p-ERKl/2增加，在30min时达到最高点。CXCR4特异性抑制剂AMD3100可抑制CXCL12对p-Akt和p-ERKl/2的诱导作用，此效应呈浓度依赖性。CXCL12和AMD3100处理均不影响总Akt和ERK1/2水平。上述研究结果表明CXCL12与CXCR4结合可激活其下游的P13 K/Akt和MAPK/ERK信号通路。 2.CXCL12/CXCR4轴激活下游PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路之间之间无交互作用。PI3K特异性抑制剂LY294002预处理GSCs可有效阻断PI3 K/Akt信号通路的激活而不影响p-ERK1/2水平；而MEK特异性的抑制剂PD98059预处理GSCs可以有效阻断MAPK/ERK信号通路而对p-Akt水平无明显影响。上述研究表明CXCR4激活下游的PI3 K/Akt和MAPK/ERK信号通路之间之间无交互作用。 3.CXCR4活化通过激活PI3K/Akt信号通路而促进GSCs迁移与侵袭。我们分别运用Transwell小室和包被Matrigel的Transwell小室检测CXCL12/CXCR4轴激活对GSCs迁移与侵袭，结果显示CXCL12以浓度依赖的方式诱导GSCs的迁移，其中在100 ng/ml CXCL12 GSCs迁移能力最强。AMD3100处理组、LY294002处理组明显抑制CXCL12刺激GSCs的迁移与侵袭，而PD98059处理组不抑制该效应，表明CXCL12/CXCR4轴激活其下游PI3 K/Akt信号通路参与促进GSCs的迁移与侵袭。 4.CXCR4活化通过激活P13K/Akt信号通路而促进GSCs分泌VEGF。ELISA结果显示，CXCL12能够诱导GSCs分泌VEGF，AMD3100处理组、LY294002处理组明显抑制CXCL12刺激GSCs分泌VEGF，而PD98059处理组无显著抑制该效应，表明CXCL12/CXCR4轴通过激活其下游P13 K/Akt信号通路而促进GSCs分泌VEGF。 综上所述，胶质瘤干细胞CXCL12/CXCR4轴激活其下游PI3 K/Akt信号通路和MAPK/ERK信号通路，且二者之间之间无交互作用。CXCL12/CXCR4轴激活促进GSCs分泌VEGF、迁移、侵袭，其下游PI3 K/Akt信号通路发挥重要作用。