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摘要目的： PRC17是个新近发现的癌基因，在多种肿瘤组织和细胞株中高表达。明确PRC17与β-微管蛋白之间的相互作用将有助于阐明PRC17的功能和其导致细胞恶性转化的机制，为肿瘤的早期诊断和防治提供新思路。 方法： 为初步鉴定PRC17癌蛋白与细胞骨架蛋白β-微管蛋白之间的相互作用，我们首先将HA-pGEX-6P-1，GST-HA-PRC17/pGEX转导入大肠杆菌BL21后，经丙醇-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）大量诱导表达GST-HA和GST-HA-PRC17融合蛋白后，在非变性条件下（1％NP40裂解液和超声破碎仪裂解细菌菌体）用Glutathione Sepharose4B对GST-HA和GST-HA-PRC17蛋白分别进行了亲和纯化。以GST-HA蛋白为对照，用GST-HA-PRC17融合蛋白与HeLa细胞裂解物进行GST pull-dwon分析，用抗β微管蛋白抗体进行Western Blot分析以检测沉淀中的β微管蛋白。 为进一步研究PRC17癌蛋白与细胞骨架蛋白β-微管蛋白之间的相互作用，通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增出人β-微管蛋白2C（beta tubulin2C，TubB2C）基因完整开放读码框架（Open reading frame，ORF），并插入pGEX-6P-1载体中构建pGEX-TubB2C重组质粒。将pGEX-6P-1和pGEX-TubB2C质粒分别转导入大肠杆菌BL21，并经IPTG大量诱导表达GST和GST-TubB2C蛋白后，在非变性条件下用Glutathione Sepharose4B对GST和GST-TubB2C蛋白分别进行了亲和纯化。用真核表达质粒HA-PRC17/pcDNA3转染培养的MCF-7细胞，以GST蛋白为对照，将纯化的GST-TubB2C蛋白与该转染细胞裂解物进行GST pull-down分析，用抗HA抗体进行Western Blot分析，以检测沉淀中的HA-PRC17蛋白。 结果： 分别用GST-HA蛋白表达质粒HA-pGEX-6P-1和GST-HA-PRC17融合蛋白表达质粒GST-HA-PRC17/pGEX转化大肠杆菌BL21后，经IPTG诱导表达的蛋白分子量均符合预期，约为29．04 kDa（GST-HA蛋白）和90．4 kDa（GST-HA-PRC17融合蛋白），而未转入任何质粒的BL21阴性对照，则在相应分子量处仅见较弱的非特异性蛋白条带。以GST-HA蛋白为对照，用GST-HA-PRC17融合蛋白与HeLa细胞裂解物进行GST pull-dwon实验后，用抗B微管蛋白抗体进行Western Blot分析，显示PRC17蛋白与β微管蛋白结合，而对照GST-HA蛋白并不结合β微管蛋白，证实PRC17蛋白可特异性结合β微管蛋白。 构建的GST-TubB2C融合蛋白原核表达质粒pGEX-TubB2C分别经BamHⅠ单酶切、EcoRⅠ和xhoⅠ双酶切后出现1045 bp和1345 bp的特征性片段，TubB2C cDNA序列经测序证实无误。大肠杆菌BL21在分别用pGEX-TubB2C和pGEX-6P-1转化后，由IPTG诱导表达的蛋白分子量均符合预期，为78 kDa（GST-TubB2C融合蛋白）和28．4 kDa（GST蛋白），而未转入任何质粒的BL21阴性对照，则在相应分子量处仅见非常弱的非特异性蛋白条带。Western Blot分析结果显示抗GST抗体可特异性识别GST-TubB2C蛋白，但不能识别阴性对照的非特异性蛋白。在非变性条件下（1％NP40裂解液和超声破碎仪裂解细菌菌体），GST-TubB2C和GST蛋白用Glutathione Sepharose4B进行了初步亲和纯化且GST-TubB2C蛋白纯度估计可达90％以上。以GST蛋白为对照，用GST-TubB2C融合蛋白与经HA-PRC17/pcDNA3转染的MCF-7细胞裂解物进行GST pull-dwon实验后，用抗HA抗体进行Western Blot分析，显示TubB2C蛋白与PRC17结合，而阴性对照GST蛋白并不能显著结合PRC17蛋白，表明TubB2C蛋白可特异性结合PRC17。 结论： PRC17癌蛋白能特异性结合β-微管蛋白2C。