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摘要革兰氏阳性菌的表面蛋白有助于病原菌吸附在宿主组织上，侵入宿主细胞，并躲避宿主免疫系统的攻击，在病原菌感染宿主过程中具有重要作用。表面蛋白主要通过一种叫分选酶的转肽酶的催化作用，而锚定到细胞壁上。金黄色葡萄球菌分选酶基因缺失突变株失去锚定表面蛋白的能力，而不能感染宿主。因此，分选酶有望成为抗感染新型靶酶。<br>　　 本研究利用GenBank中的分选酶A基因序列设计特异性引物，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得618bp的DNA片段。利用TA克隆技术，PCR产物插入T载体中构建得到重组载体pMD20-srtA和pMD19-srtA。按常规分子克隆技术最终成功构建两种原核表达载体pet22-srtA和pTRX-srtA，测序结果业已递交到GenBank中，登录号分别是FJ439573和FJ439574。<br>　　 两种重组表达载体通过化学方法转入大肠杆菌感受态BL21（DE3）中，在1mmol/LIPTG诱导下进行表达。利用SDS-PADE和western blot进行鉴定和分析，结果显示：重组载体pet22-srtA和pTRX-srtA分别表达出相对分子量为约45kDa和39kDa的外源蛋白；在重组质粒pet22-srtA中分选酶基因主要以包涵体形式表达；在重组质粒pTRX-srtA中分选酶基因实现可溶性表达，说明分子伴侣硫氧还蛋白（Trx）有利于分选酶基因的原核表达。利用融合蛋白的组氨酸标签，通过亲和层析对重组分选酶A蛋白进行纯化，纯度达到90％左右。<br>　　 本研究根据酵母表面展示技术，提出了分选酶活性检测新方法。为此，采用PCR技术，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板扩增得到纤连蛋白结合蛋白B基因（fnbB），并克隆到T载体中得到重组载体pMD19-fnbB，经测序比对其匹配率为95％。<br>　　 本研究在大肠杆菌中实现了分选酶基因的克隆表达，对分选酶活性新型检测方法进行初步研究，为分选酶的酶学性质研究特别是抑制剂筛选研究奠定良好基础，有助于缓解日益严重的致病菌耐药性问题。