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摘要越野他汀(Kosinostatin)是2002年由日本科学家从海洋来源的小单孢菌(Micromonospora.sp.Al304)中分离到的蒽环类抗肿瘤抗生素，其生物活性是已知的蒽环类抗生素中较高的(IC50≈0.10μM，比临床上广谱抗癌药阿霉素要高)，并且其结构非常特殊。我们以越野他汀为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，阐明其生物合成机制，为通过代谢工程改造生产更多的蒽环类抗生素奠定基础。<br>　　 通过Micromonospora.sp.Al304与E. coli S17-1之间的属间接合转移成功地建立了越野他汀宿主菌的遗传转移系统，并通过改造培养基使得接合转移效率提高了两个数量级。<br>　　 采用pCC1FOS为黏粒载体，构建了Micromonospora.sp.Al304良好的基因组文库，效价达到25000 cfu/μg DNA。依据II型聚酮合成酶(polyketide synthetase，PKS)中酮基合成酶(ketosynthase，KS)和链延伸因子(chain length factor，CLF)的保守基序设计了简并性引物，PCR扩增得到编码II型PKS的基因片段，标记为探针进行文库筛选；同时依据dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶的保守基序设计简并性引物，对通过文库筛选得到的黏粒进行PCR扩增得到特异性基因片段，在基因型上证实所得到的黏粒与越野他汀生物合成相关，这样就成功地克隆了Micromonospora.sp.Al304基因组上长约46kb的DNA区域。对kst17(编码KS)的基因中断证明了所克隆到的基因簇的正确性。<br>　　 通过黏粒克隆测序获得了约37kb的与越野他汀生物合成相关的连续核苷酸序列，其中包含了35个orf:9个负责蒽环骨架合成的基因，8个负责含氮边链合成的基因[包括2个非核糖体聚肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)基因]，7个负责脱氧糖基合成的基因，2个调节基因，4个抗性基因和5个未知功能的基因。我们认为含氮边链的生物合成与蒽环骨架的生物合成是各自独立的，NRPS的腺苷化酶可能识别并激活γ羧基谷酰胺，II型PKS以丙二酰辅酶A起始延伸九次并采用蒽环类环合方式。根据对基因所编码蛋白的功能分析，我们推测了越野他汀的生物合成途径。<br>　　 同位素标记的CH3COONa喂养实验证明越野他汀和异醌环素B中蒽环结构来源于乙酸单元，并确定II型PKS以丙二酰辅酶A起始延伸九次并采用典型的链霉菌蒽环类环合方式；对kst26的基因中断初步证明Kst26可能负责含氮边链与蒽环骨架的连接；对kst34的基因中断初步证明Kst34与脱氧糖的转乙酰相关；同时，对kst2、kst4和kst9的基因中断证明这些基因与越野他汀的生物合成相关。<br>　　 总之，遗传转移系统的建立为体内遗传学的研究提供了技术基础；越野他汀生物合成基因簇的克隆、序列测定及分析为越野他汀生物合成机制的研究提供了分子水平的遗传基础。越野他汀生物合成机制的初步研究不仅对阐明蒽环类抗生素的生物合成和后修饰方式具有重要意义，而且为在简单、发酵友好的微生物中重组结构更复杂、生物活性更高的蒽环类抗生素的生物合成途径提供了可能。