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摘要喜树碱(Camptothecin，CPT)是重要的抗肿瘤先导化合物，具有显著的体内外抗肿瘤活性，对其化学结构的修饰优化一直是抗肿瘤药物研发的重要方向。目前已有三个CPT衍生物先后在国内外进入临床使用，在肿瘤化疗中发挥着举足轻重的作用。近年来对CPT的化学结构改造集中在脂溶性衍生物的研究，特别是一系列7位取代的脂溶性CPT衍生物，显示优于现有水溶性衍生物的抗肿瘤活性和药理学性质。但是对另一个结构改造的有利位点—9位的脂溶性修饰的研究还鲜有报道。<br>　　 CPT类化合物的抗肿瘤作用机制是捕获DNA拓扑异构酶I(TopoisomeraseI，Topo I)在催化过程中形成的Topo I-DNA可切割复合物(Cleavable complex)，后者与行进中的DNA复制叉或转录复合物作用，继发地造成DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSBs)。DSBs能激活细胞内复杂的DNA损伤应答系统，其中DNA修复和细胞周期阻滞通路对于维持DNA分子结构的完整性以及细胞存活和正常功能发挥具有重要作用。深入了解这两条通路的分子机制及其内在联系将有助于全面阐明CPT类化合物引起的DNA损伤应答信号转导过程。<br>　　 吉咪替康(Chimmitecan)是中国科学院上海药物研究所设计合成的新的CPT衍生物。该化合物是基于近年来新的CPT结构改造策略，设计简洁的合成路线得到的9位取代的脂溶性CPT衍生物。本研究旨在评价Chimmitecan的体内外抗肿瘤作用，并与临床上广泛使用的两个CPT衍生物拓扑替康(Topotecan，IPT)和伊立替康(Irinotecan，CPT-11)进行比较，全面阐释Chimmitecan作为抗肿瘤药物候选化合物和现有CPT类药物相比的潜在优势。同时，深入探讨Chimmitecan引起肿瘤细胞DSBs继而激活的DNA修复和细胞周期阻滞的分子机制和相互关系，为阐明CPT类化合物触发肿瘤细胞的DNA损伤应答机制提供新的证据。<br>　　 首先，采用MTT和SRB法在20株不同组织来源的人肿瘤细胞株上证实，Chimmitecan比包括TPT和SN38(CPT-11的体内活性形式)在内的多个CPT衍生物具有更强的体外细胞毒作用，IC50介于5～500 nM，对20株细胞的平均IC50为83 nM，明显低于TPT(282 nM)和SN38(191 nM)。同时，本文作者综合比较了Chimmitecan和TPT、SN38的药理学特性。在K562/A02、MCF-7/ADR、KB/VCR株多药耐药(Multi-drug resistance，MDR)细胞及其亲本细胞上证实了Chimmitecan的抗MDR作用，通过耐药因子的比较，发现该化合物的抗MDR作用明显优于TPT和SN38，更好地保持了母核CPT的抗MDR优势；选用对Chimmitecan敏感的HL60细胞，证实Chimmitecan对肿瘤细胞的细胞毒作用不受人血清白蛋白(HSA)的影响：并且Chimmitecan能快速入细胞，作用15 min就能在细胞内达到较高的蓄积浓度。继上述细胞水平的评价，本文作者进一步采用分子对接的方法研究了Chimmitecan与Topo I-DNA可切割复合物的结合模式，推测该化合物与可切割复合物较高的亲和力可能是其抗肿瘤活性优势的根本机制。这一推论在包括Topo I介导的pBR322解旋实验、DNA切割实验、Band Depletion Assay和NaCl介导的DNA切割逆转实验等多个分子和细胞水平的生物学实验上都得到了证实。发现Chimmitecan对Topo I催化活性的抑制作用强于TPT和SN38；在较低浓度能有效的捕获Topo I-DNA可切割复合物，且作用强于TPT和SN38；捕获的可切割复合物的稳定性明显强于TPT，和SN38相当。Chimmitecan对Topo I的作用在下游的细胞生物学效应，即造成细胞DNA损伤、引起细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡的能力上都得到了很好的体现，其作用强度与SN38相当，明显强于TPT。Chimmitecan的上述多项优势，最终体现为其卓越的体内抗肿瘤活性。该化合物在A549肺癌、BEL-7402肝癌、MDA-MB-435乳腺癌和HCT-116结肠癌多种裸小鼠人移植瘤模型上显示了广泛的体内抗肿瘤作用，总体抗肿瘤活性和CPT-11相当，但两者显示出不同的选择性，其中在A549肺癌和BEL-7402肝癌模型上Chimnutecan的抑瘤活性优于CPT-11。另外，Chimmitecan口服有效。上述实验结果充分表明，Chimmitecan与TPT、CPT-11相比体内外抗肿瘤活性和药理学特性都有其独特的优势和特点。<br>　　 其次，本研究试图阐明Chimmitecan激活肿瘤细胞DNA损伤应答效应中DNA修复和细胞周期阻滞通路的分子机制。中性单细胞凝胶电泳法及免疫荧光和Western Blot检测的组蛋白H2AX磷酸化(γ-H2AX)都显示25或100 nMChimmitecan和CPT作用1h能引起HCT-116结肠癌细胞显著的DSBs损伤。撤药孵育6h发现DNA损伤程度明显减弱，提示药物引起的DSBs可能在短时间内被激活的DNA修复系统所修复。检测撤药后不同时间点细胞DSBs水平和RAD51灶形成指示的同源重组修复通路(Homologous recombination，HR)激活的动态变化，发现两者具有很好的相关性。进一步用RAD51特异的小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)降低细胞内RAD51蛋白水平，上述修复过程被抑制，表现为持续的DSBs损伤，提示Chimmitecan引起的DSBs能在6h内被RAD51介导的HR修复通路及时有效地修复。同时，检测了相同条件下Chimmitecan和CPT作用引起HCT-116细胞周期阻滞的动态变化过程。发现撤药后HCT-116细胞先发生短暂的S期阻滞，继而过渡为长期的G2/M期阻滞直到72 h时细胞周期分布恢复正常。其中G2/M期阻滞的发生是通过激活损伤应答系统的中心分子ATM和ATR，进而磷酸化激活下游周期检查点激酶Chk1和Chk2，并最终抑制细胞周期蛋白依赖性激酶Cdc2的活性引起的。最后，本文作者试图揭示Chimmitecan激活的HR修复和细胞周期阻滞两条通路的相互关系。一方面，采用RAD51 siRNA干扰细胞HR修复的正常功能会阻碍撤药培养72 h后细胞周期的恢复，使细胞长期停滞于G2/M期检查点；另一方面，分别应用Chk1和Chk2的siRNA抑制Chimmitecan激活的细胞周期阻滞通路，能够不同程度地阻断、抑制或减慢HR修复。上述实验结果提示，Chimmitecan激活的HR修复和细胞周期阻滞通路很可能是一种相互影响、相互制约的关系。<br>　　 综上所述，本研究通过与临床上正在使用的CPT衍生物进行比较，证实Chimmitecan是一个更强的Topo I毒剂，具有显著的体内外抗肿瘤活性。更重要的是，独特的化学结构改造策略赋予了该化合物一些卓越的药理学特性，如优越的抗MDR作用；细胞毒性不受HSA的影响；独特的体内选择性；易于溶解；合成容易等。因此，本文作者认为Chimmitecan作为新的抗肿瘤药物候选化合物，具有优于现有化合物的综合性质。目前Chimmitecan已经进入系统的临床前研究阶段，很有希望成为具有自主知识产权的抗肿瘤一类新药。对于Chimmitecan激活的HR修复和细胞周期阻滞通路之间相互联系的研究揭示这两条通路被同时激活、并行发展、相互影响、相互制约。这些结果丰富和完善了以往对于DNA损伤应答系统中细胞周期阻滞和DNA修复相互关系的认识，为最终阐明CPT类化合物引起的DNA损伤应答系统以及优化该类化合物临床治疗效果提供了新的线索。本论文的部分工作已作为封面文章在国际权威肿瘤学杂志Clinical Cancer Research上发表，表明国际同行对本文作者工作的高度肯定。