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摘要2005年5～6月，在中国青海省青海湖，包括斑头雁、鱼鸥和棕头鸥等在内的6000多只候鸟死亡。经病原体的分离鉴定，确定引起这次候鸟大批死亡的病原体是H5N1高致病性禽流感病毒。遗传变异分析发现，这些H5N1分离株是发生重排后的病毒。分离株有一些共同的分子特征：首先，HA蛋白裂解位点处为多碱基序列；其次，PB2蛋白中决定病毒毒力的627位的氨基酸，均为E627K突变；再次，NA茎部20个氨基酸缺失。动物试验表明，该毒株对鸡和小鼠均是高致死性的，对鸭也有一定的致病性。根据序列比较，毒力测定以及发病候鸟的迁徙路线推测，这些分离株可能是候鸟在东南亚越冬时被感染、且在候鸟体内发生重排的结果。候鸟春季迁徙时将病毒携带到青海湖，引起了这次禽流感的暴发。<br>　　 通过比对分析，发现青海湖株H5N1候鸟分离株的HA蛋白同其它毒株相比，有个独特的氨基酸突变R339G。本研究利用反向遗传学构建了以A/WSN/33(H1N1)为背景，替换青海湖HA基因或HA突变体(G339R)和NA的重组病毒，对这些重组病毒的一些生物学特性和对小鼠的致病性进行了研究，以期为这个突变位点的存在意义作出一些解释。对重组病毒HAQhNAQh/WSN和HAQh(G339R)NAQh/WSN的生物学特性的鉴定发现，二者在MDCK细胞及鸡胚中均能良好地生长，对小鼠均具有高致病力。这些结果表明，这一位点的突变与病毒的对鸡胚和小鼠的致病力无关，而可能与候鸟这一特定的宿主有关，这需要在今后开展更多的分子流感行病学数据来加以证实。<br>　　 H5N1流感病毒跨越了种间障碍，感染并引起人的死亡，但是并没有获得人际传播能力。H5N1流感病毒可能不会止步于此，它要么发生某些点突变，要么通过与人流感病毒如H1N1或H3N2发生重组，以获得与人流感受体相结合的高度特异性，和在人体内复制的泛嗜性。本研究对最后一个方面进行了研究，从H5N1两个蛋白HA和NA出发，将其与H1N1亚型流感病毒相对应片段进行替换，探索人－禽流感病毒重组的概率大小问题。研究发现，将H5N1病毒HA和NA同时替换H1N1的相应片段，所拯救出的重组病毒在MDCK及鸡胚中都能很好扩繁，而单独替换HA基因的重组病毒虽然能在MDCK细胞上良好的生长繁殖，但是在鸡胚中的复制能力却很差。此外，单独替换NA基因很难包装成功。这就说明HA和NA这两个蛋白存在着一定的相互作用或协同性，这也可能限制了H5N1病毒同H1N1病毒重组的发生。为了研究这种限制性因素，本研究从内部其它6个片段及NA基因(序列比对发现，青海湖NA基因与A/WSN33的氨基酸水平的同源性为82.0％)两个方面进行了一定的探索，结果发现这与内部片段无关，也与NA的茎部区域无关。此外，研究发现，H5亚型的HA蛋白为了能与H1N1亚型的NA蛋白相协同，在鸡胚上良好生长，经历了一些随机突变的过程，但最终固定下来的突变是HA受体结合位点附近的一个氨基酸K234E/N，其结果可能会减弱HA与受体结合的能力。要找到决定HA与NA协调性工作的主要因素，仍需进行进一步研究。<br>　　 H5N1亚型高致病性禽流感病毒的暴发给世界养禽业造成了严重危害，同时，也严重地威胁到人的健康和生命。疫苗免疫是防制H5N1流感病毒在人群中暴发的最有效的手段之一。本研究以小鼠为动物模型，对插入有H5亚型流感病毒A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05的HA基因的重组痘病毒载体疫苗rVT-T-HA进行了免疫原性、免疫途径、同源和异源病毒的保护性及最小免疫剂量等项疫苗指标的实验评估。结果发现，重组病毒rVTT-HA经肌注、滴鼻和口服三种不同免疫途径接种小鼠后，肌注和滴鼻组免疫效果相对较好，均能够诱导小鼠产生很高的HI抗体和中和抗体，可以提供100％的同源保护，但是，口服组抗体水平不均一，保护率只有60％；在交叉保护试验中，疫苗组同源及异源保护率达100％。如将这种疫苗制成喷雾剂式的产品，直接喷到人的鼻内，是既简单又方便，不失为人类应对未来流感的暴发的一种新的疫苗储备。