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摘要膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤。世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十位之后，其中超过90％的膀胱癌为尿路上皮癌(UC)，具有易复发和进展的特点。膀胱癌发病的具体分子机制目前尚不明确，与其他恶性肿瘤一样，膀胱癌的发生是多基因、多阶段变异累积形成的病理过程，也是一个涉及多基因、多信号通路参与的复杂过程。目前膀胱癌发病、复发和进展的分子机制仍然是泌尿外科的研究热点。表观遗传学机制在肿瘤中具有重要作用，其中抑癌基因启动子甲基化可引起染色体结构和稳定性的改变，导致基因表达失活，参与肿瘤的发生和发展。研究发现抑癌基因的异常甲基化不是随机出现的，其具有基因特异性和肿瘤特异性，已在膀胱癌、前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤患者的组织和血液、尿液等体液中发现多种抑癌基因的异常甲基化，同时其甲基化同肿瘤的分期和分化及预后相关，并可能成为肿瘤特异性的分子标记物。另外基因启动子甲基化改变不涉及DNA序列的改变，是可逆的，可被DNA甲基转移酶抑制剂逆转，恢复抑癌基因的表达，通过诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡抑制细胞的增值，可能成为肿瘤治疗的新途径。因此，研究膀胱癌中抑癌基因的甲基化对理解膀胱癌的发病机制、建立新的肿瘤标记物以及预后分析和治疗均具有重要意义。<br>　　 组蛋白乙酰化修饰也是表观遗传调控主要的研究内容之一，其通过改变染色质的构型调控基因转录，组蛋白乙酰化促进基因转录，去乙酰化抑制基因转录。目前研究发现DNA甲基化同组蛋白乙酰化具有密切关系，组蛋白去乙酰化是DNA甲基化抑制基因转录的重要下游机制之一。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可增强表观抑制的抑癌基因的表达，抑制细胞增殖，在肿瘤的表观遗传学治疗中具有重要意义。<br>　　 凋亡蛋白酶活化因子-1基因(Apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1)和腺瘤性结肠息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)是两种重要的抑癌基因，分别在线粒体凋亡途径和Wnt信号传导通路调控中发挥着重要作用，而膀胱癌中Apaf-1、APC基因表观遗传学调控机制的研究报道较少。本研究通过甲基化特异性PCR方法检测膀胱移行细胞癌组织中Apaf-1和APC的启动子甲基化状态，分析两种抑癌基因的启动子甲基化状态与膀胱癌临床特点及复发的关系，并检测人膀胱癌T24细胞株中Apaf-1基因启动子的甲基化状态，并应用不同浓度的DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)对膀胱癌T24细胞株进行处理，观察其细胞生物学行为改变和Apaf-1基因的表达情况，鉴于组蛋白乙酰化调节与启动子甲基化的重要关系，本研究进一步应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)体外作用于人膀胱癌T24细胞株，观察其细胞生物学行为改变和Apaf-1、APC表达的变化。本研究为探讨膀胱癌发生、发展的机制和建立临床早期诊断和预后的标记物提供实验依据，并为膀胱癌的表观遗传学治疗提供新的靶点。本研究分为三个部分：<br>　　 第一部分：膀胱癌抑癌基因Apaf-1和APC的甲基化状况及其临床意义。<br>　　 目的：研究抑癌基因细胞凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)和腺瘤性结肠息肉病基因(APC)的启动子甲基化状况与膀胱癌临床病理的关系及对患者复发的影响。<br>　　 方法：采用甲基化特异性PCR方法检测110例膀胱癌组织中Apaf-1和APC的启动子甲基化状态，以15例正常膀胱黏膜组织为对照组。<br>　　 结果：Apaf-1和APC基因在膀胱癌组织中的甲基化率为90.0％和82.7％，在正常膀胱组织为6.77％和20.0％，差异分别有统计学意义(P均=0.000)。膀胱癌中Apaf-1及APC基因的甲基化率随肿瘤分级、分期的增加而升高，而不同性别、不同年龄以及肿瘤单发与多发之间的比较分别无显著性差异(P均＞0.05)。有淋巴结转移的患者Apaf-1启动子甲基化阳性率明显高于无淋巴结转移的患者(P＜0.05)。在复发组与未复发组的比较中，Apaf-1的甲基化阳性率分别为97.6％(41/42)和85.3％(58/68)，差异有统计学意义(x2=4.382，P=0.036)，而APC的甲基化率分别为85.7％(36/42)和80.9％(55/68)，差异无统计学意义(x2=0.424，P=0.515)。<br>　　 结论：Apaf-1及APC基因启动子甲基化在膀胱癌的发生、发展过程中具有重要作用，Apaf-1启动子甲基化可能成为膀胱癌患者预后判断的分子标志物。<br>　　 第二部分：5-氮杂-2，-脱氧胞苷对人膀胱癌T24细胞系增殖及Apaf-1基因表达的影响。<br>　　 目的：观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人膀胱癌T24细胞增殖、凋亡的影响及对Apaf-1基因表达的影响。<br>　　 方法：甲基化特异性PCR(MSP)方法检测膀胱癌T24细胞株中Apaf-1基因的甲基化状态；应用不同浓度的5-Aza-CdR处理人膀胱癌T24细胞，噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长抑制率；流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化情况；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Apaf-1基因mRNA水平改变；Westernblot法检测Apaf-1蛋白的表达变化。<br>　　 结果：T24细胞Apaf-1基因启动子呈甲基化状态；5-Aza-CdR对T24细胞的生长具有明显的抑制作用，5-Aza-CdR作用后T24细胞出现细胞周期阻滞，细胞凋亡率明显增加。5-Aza-CdR处理组中Apaf-1基因的mRNA和蛋白表达较对照组明显增加。<br>　　 结论：T24细胞Apaf-1基因启动子呈甲基化状态，5-Aza-CdR可增强Apaf-1基因的表达，通过诱导T24细胞凋亡和周期阻滞抑制T24细胞的生长。<br>　　 第三部分：曲古抑菌素A对膀胱癌T24细胞增殖及Apaf-1和APC基因表达的影响。<br>　　 目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人膀胱癌T24细胞的增殖抑制作用及对Apaf-1、APC基因表达的影响。<br>　　 方法：采用3×104 mmol/L TSA作用T24细胞，MTT法检测TSA对T24细胞生长的抑制作用；流式细胞术(FCM)检测TSA作用前后T24细胞周期和凋亡的变化；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TSA作用前后膀胱癌细胞中Apaf-1、APC mRNA表达的变化。<br>　　 结果：TSA对T24细胞的生长具有明显的抑制作用；TSA作用后T24细胞的G0/G1期比例增加，S期比例减少，细胞凋亡率增加(P＜0.05)；RT-PCR结果显示TSA处理能明显诱导Apaf-1、APC基因表达增加。<br>　　 结论：TSA能抑制T24细胞体外生长，诱导细胞周期阻滞和凋亡，其可能通过诱导Apaf-1、APC基因表达增加而发挥体外抗膀胱癌作用。