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摘要目的:胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是胃肠道最常见的间叶来源肿瘤，起源于比消化道间质Cajal细胞(interstitial cell of Cajal，ICC)更原始、向ICC分化的间叶多能干细胞。广泛表达KIT蛋白为GIST的重要病理特征，GIST中c-kit基因功能获得性突变和小分子靶向治疗药物imatinib在GIST治疗中的使用，使GIST的相关研究成为热点。研究认为，c-kit基因发生功能获得性突变，导致KIT蛋白因自主磷酸化而持续活化，进而激活下游细胞增殖信号，使细胞增殖分化失控，形成肿瘤，此为GIST的主要发病机制。此外，还有少部分GIST病例中存在PDGFRA基因功能获得性突变，这种突变与c-kit突变相同，也能够引发下游相同的细胞信号传导通路的激活。小分子酪氨酸酶抑制剂imatinib能够与ATP竞争性地结合KIT酪氨酸激酶催化部位的核苷酸位点，使激酶不能发挥催化活性，底物的酪氨酸残基不能被磷酸化，不能与下游的分子进一步作用，从而导致细胞增殖受抑，发生凋亡。Imatinib能够有效诱导GIST肿瘤消退，其作为复发、转移及不能手术的GIST病人的首选治疗方案已达成共识，然而近年来临床研究发现有15％～20％的病例对imatinib原发性耐药，并且还有更多的病例发生对imatinib的继发性耐药，耐药成为影响imatinib疗效的主要问题。目前，包括c-kit基因二次突变理论在内的对imatinib耐药机制的研究仍然不够深入，无法彻底解释GIST对imatinib的耐药问题，因此，寻找GIST新的发生发展机制，能够为探索imatinib耐药问题提供新的思路。在GIST中广泛表达的KIT蛋白为Ⅲ型酪氨酸激酶受体，正常情况下的活化需要其配体干细胞因子(stemcell factor，SCF)的参与，与配体结合后，受体在细胞膜上迁移、聚集形成二聚体，使得胞内酪氨酸残基磷酸化，激活胞内多条细胞信号通路，最终调控正常造血细胞、黑色素细胞和消化道cajal细胞等的生长、增殖和分化。近年来有研究发现，在白血病、恶性黑色素瘤、小细胞肺癌等多种肿瘤中存在SCF/KIT通路的活化，其活化是促进肿瘤细胞的增殖与转移的重要机制。因此，SCF是否在GIST中表达并发挥其生物学作用值得去研究探讨，同时，这种依赖配体的KIT受体激活是否是GIST中KIT蛋白活化的另外一条重要途径，imatinib能否有效抑制这种依赖配体的受体活化，对这些问题的研究能够为寻找GIST的发生发展机制、解释imatinib的耐药问题及寻找GIST新的治疗靶点提供思路。因此，本课题旨在探讨GIST中是否存在配体依赖的SCF/KIT通路的激活，该通路的激活能否促进GIST细胞的增殖，以及该通路的激活与imatinib耐药是否相关。<br>　　 方法:<br>　　 1、收集已确诊为GIST的石蜡组织及新鲜组织标本共68例，免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)及免疫蛋白印迹(western blot)技术检测GIST组织中SCF的表达，同时并分析SCF表达与肿瘤部位、大小、病理性核分裂数/50HPF、肿瘤危险度分级及Ki-67增殖指数的关系；<br>　　 2、抽提GIST组织基因组DNA，以此为模板，采用PCR方法扩增c-kit基因最常见的突变位点外显子11、9和PDGFRA基因外显子18、12，将PCR产物进行DNA直接测序，检测GIST中c-kit及PDGFRA基因的突变状态，结合SCF的表达情况，分析SCF表达与GIST突变状态有无相关性；<br>　　 3、采集手术切除的新鲜GIST标本，采用机械分离法将组织块分离，获得GIST原代细胞接种至细胞培养皿中，予含20％胎牛血清的1640-RPMI培养液，放至37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，隔日进行细胞计数，绘制细胞生长曲线，以观察原代细胞生长增殖状态；<br>　　 4、将生长状态良好的GIST原代细胞接种96孔板，细胞贴壁后予血清饥饿4小时，随后给予不同浓度人重组干细胞因子(recombinant human SCF，rhSCF)刺激，72小时后采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)检测细胞增殖活性并绘制细胞增殖曲线；<br>　　 5、生长状态良好的GIST原代细胞，予血清饥饿4小时后，给予100ng/ml rhSCF刺激，5、15和60分钟后分别收集细胞提取总蛋白，采用Western blot蛋白免疫印迹技术检测给予SCF刺激后GIST细胞中KIT蛋白的磷酸化水平；<br>　　 6、不同浓度imatinib与GIST细胞共同孵育，72小时后收集细胞提取总蛋白，采用Western blot方法检测SCF蛋白的表达，检测酪氨酸酶抑制剂imatinib是否影响SCF的表达；<br>　　 7、与不同浓度imatinib共同孵育的GIST细胞，再给予浓度为100ng/ml rhSCF刺激，10分钟后收集细胞提取总蛋白，采用Western blot方法检测细胞中KIT蛋白的磷酸化水平，探讨imatinib是否对依赖配体SCF的KIT受体激活能够有效抑制。<br>　　 结论:<br>　　 1、GIST中存在SCF蛋白的高表达及SCF和KIT的共表达，且SCF表达阳性的GIST中，肿瘤增殖相关指标均呈增强或增高趋势，提示：GIST组织中存在SCF自分泌，SCF可能通过自分泌途径促进GIST细胞的增殖。<br>　　 2、本研究所检测的GIST标本中，c-kit及PDGFRA基因的突变位点均位于功能性突变热点区。SCF表达与c-kit基因突变状态及外显子突变位点和类型之间均无明显相关性，提示在GIST中，无论是否存在突变导致的不依赖配体的KIT受体自动磷酸化，KIT受体都可能被其配体SCF所激活，即依赖配体的SCF/KIT通路可能是除配体非依赖性激活之外的KIT蛋白的另一条独立有效激活途径。<br>　　 3、体外培养GIST原代细胞实验进一步表明：SCF能够有效激活GIST细胞中的KIT受体使其磷酸化，对GIST细胞的增殖有明确的促进作用。<br>　　 4、Imatinib在体外能够促进GIST细胞中SCF的表达增强，提示imatinib的使用可能会反馈性促使SCF自分泌增加，随后的western blot检测也证实治疗剂量的imatinib无法抑制依赖配体SCF的KIT受体磷酸化，该结果提示SCF/KIT通路的激活可能是imatinib发生耐药的重要机制之一。<br>　　 综上认为：GIST中存在SCF的自分泌途径，配体依赖的SCF/KIT通路能够促进GIST细胞的增殖。GIST中KIT受体激活存在非配体依赖和配体依赖的两条途径，同时抑制这两条通路可能可以更有效地阻止GIST细胞的增殖。因此，本研究为深入研究胃肠道间质瘤的发生发展机制奠定了实验基础，也为进一步寻找新的靶向治疗药物提供了新的思路。