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摘要目的:EPCs的动员机制存在多个环节，如黏附、降解、运动、迁移等。在机体某些生理或病理状态下，外周血中EPCs的数量和功能也会发生变化。去甲肾上腺素是人体交感神经的主要的神经递质之一。其对于EPCs动员的影响仍不是十分清楚。本研究的目的是：探讨NE对肢体缺血C57小鼠EPCs动员的影响，以及对体外培养的人EPCs的增殖、迁移能力的影响；探讨MAPK信号通路介导NE的促进EPCs的作用以及beta-arrestin2在EPCs功能调节中的作用。<br>　　 方法:<br>　　 本课题从在体实验水平、细胞实验水平和分子调控机制等多个层面逐层深入研究NE调节EPCs动员的机制。<br>　　 (1)在体实验：采用结扎股动脉的方法制备左下肢缺血的小鼠模型，于术后的第1至5天每天给予药物腹腔注射，具体药物以下：NE10-8mol、α阻滞剂酚妥拉明10-8mol、betal受体阻滞剂美托洛尔10-8mol和beta2受体阻滞剂10-8mol。于术后第7天取骨髓单个核细胞、脾脏细胞和小鼠外周血单个核细胞，流式检测CD34+KDR+的细胞所占的比率。<br>　　 (2)细胞功能学研究：在体外培养人外周血EPCs的培养基中加入不同浓度的NE(0、0.01、0.1、1、10、100μM)干预72小时， MTT评价EPCs的增殖能力，Transwell小室实验评价EPCs的迁移能力。<br>　　 (3)细胞信号研究：Western-blot检测检测丝裂原激活蛋白激酶(MitogenActivated Protein Kinase，MAPK)，即细胞外信号调节激酶Erk1/2、c-Jun氨基端激酶Jnk和p38 MAPK的磷酸化水平。<br>　　 (4)细胞信号通路的蛋白调控机制研究：随机选取4名对照者和4名糖尿病患者的外周血30ml，分离PBMCs，Western-blot检测beta-arrestin2的表达。基因沉默的方法干扰EPCs beta-arrestin2的表达，Realtime PCR和Western-blot的方法评价沉默的效率，采用MTT何Transwell小室实验的方法研究beta-arrestin2在EPCs增殖能力和迁移能力的调控中的作用。<br>　　 结果:<br>　　 (1)在体实验发现：NE能够显著地促进肢体缺血C57小鼠骨髓EPCs的增殖以及其动员进外周血的能力。注射了NE组的C57小鼠骨髓的EPCs的数量从2.0±0.4％增加到4.7±0.9％，p＜0.05，动员进外周血的EPCs的数量从1.2±0.6％增加到6.2±1.9％，p＜0.05，脾脏的EPCs的数量从2.5±0.8％增加到3.1±1.0％，p＜0.05。而NE的这种作用能够被α肾上腺素受体阻断剂酚妥拉明和beta2肾上腺受体阻断剂I127阻断，但是不能被betal肾上腺素受体阻断剂阻断。<br>　　 (2)细胞功能学实验发现：NE能够浓度依赖性地促进体外培养的EPCs的增殖，其中以NE10μM的作用最强，其增殖率为103.6±54.6％，P＜0.05，NE的促进EPCs增殖作用能够被酚妥拉明和I127阻断，但是不能被美托络尔阻断。另外ERK1/2抑制剂A6355和eNOS抑制剂L-NAME能够阻断也能够阻断NE的这种作用，P＜0.05，但是JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂PD169318、PI3K抑制剂LY1940021μM、、p65抑制剂RO106-9920和NO供体SNP均无类似作用，P＞0.05。NE能够显著地促进EPCs的迁移能力(124.1±12.2 VS71.7±19.6，P＜0.05)，酚妥拉明和I127能够阻断NE的促迁移能力(57.2±14.3 VS124.1±12.2，P＜0.05和61.3±11.5 VS124.1±12.2，P＜0.05)，而美托洛尔无类似作用(112.8±26.0 VS124.1±12.2，P＞0.05)。<br>　　 (3)细胞信号通路的研究发现：NE能够浓度依赖性地增加EPCs的Erk1/2和信号分子Src的的磷酸化，P＜0.05，而I127能够减轻Erk1/2和Src的磷酸化，P＜0.05，酚妥拉明和美托络尔则没有类似作用，P＞0.05。<br>　　 (4)信号调控机制研究发现：基因沉默beta-arrestin2后，EPCs对VEGF的敏感性显著地增加(33.7±6.4％VS2.1±1.4％，P＜0.05)，而EPCs对NE的敏感性显著地减少(26.6±7.8％VS64.0±13.5％，P＜0.05)。基因沉默beta-arrestin2后，EPCs的迁移能力下降，对NE的敏感性下降。<br>　　 结论:NE促进肢体缺血时骨髓EPCs的动员以及增殖、迁移能力。NE能够激活EPCs Src-MAPK信号通路，而beta-arrestin2参与EPCs的增殖和迁移能力的调节。