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摘要P90核糖体S6激酶(ribosomal S6 kinase,RSK)家族是胞外信号调节激酶(extracellular-signal-regulated kinase,ERK)的底物,是Raf-MEK-ERK级联信号通路下游重要的一级效应分子,通过磷酸化大量的细胞内蛋白来调节细胞分裂、存活、和分化等。在哺乳动物中,RSK家族已证实的有4个成员,RSK1-3通过磷酸化的底物进而促进细胞增殖、存活和分化。已有但为数不多的文献表明,RSK4基因可能发挥抑癌基因的作用。本课题以非小细胞肺癌细胞株和肺癌组织为对象,研究非小细胞肺癌中RSK4的表达情况、临床意义和生物学功能。<br>　　 第一部分 RSK4在肺癌细胞株及组织中的表达及意义<br>　　 目的：<br>　　 观察P90核糖体S6激酶-4(RSK4)在肺癌细胞株中的表达情况,在肺癌及癌旁组织中的表达情况及其与临床病理因素的关系。<br>　　 方法：<br>　　 1)细胞系,细胞培养:人肺腺癌细胞系SPCA1和A549,肺鳞癌细胞系NCI-H520和高转移肺巨细胞癌细胞株95D,大细胞肺癌细胞系NCI-H460,常规培养.<br>　　 2)组织标本:收集40例不同类型的非小细胞肺癌以及相对应的癌旁组织标本。<br>　　 3)RSK4mRNA表达水平分析:采用半定量RT-PCR技术分析。<br>　　 4)RSK4蛋白表达水平检测:Western Blot分析和免疫组化。<br>　　 5)应用统计软件13.0分析RSK4的表达与临床病理因素的关系。<br>　　 结果：<br>　　 1)6种肺癌细胞株中均有RSK4mRNA表达,但表达水平差异显著,最高和最低的相差5.15倍。RSK4蛋白在6种细胞中的表达与mRNA表达基本一致。<br>　　 2)RSK4 mRNA在大多数癌组织表达水平低于癌旁组织,具有统计学意义(p=0.018,p<0.05),RSK4mRNA的表达与患者的病理类型、组织分型及有无淋巴结转移无关,但与肿瘤大小(p=0.035,p<0.05)和TNM分期(p=0.036,p<0.05)有关。<br>　　 3)癌组织与癌旁组织中RSK4蛋白表达有差异。RSK4蛋白的表达与患者的年龄、性别、细胞类型及细胞分化程度无关,但与肿瘤大小(p=0.038,p<0.05)、TNM分期(p=0.001,p<0.05)及淋巴转移(p=0.004,p<0.05)有关。<br>　　 结论：<br>　　 1)RSK4在不同肺癌细胞株中有表达,但差异较大。<br>　　 2)在大多数病例中,RSK4 mRNA和蛋白在癌组织的表达水平低于在癌旁组织的表达水平。表达水平与患者的年龄、性别、细胞类型及细胞分化程度无关,但与肿瘤大小、TNM分期及淋巴转移有关。RSK4的表达水平随疾病进展而逐渐降低<br>　　 第二部分肺癌RSK4表达与细胞生物学行为的关系<br>　　 目的：<br>　　 通过调节RSK4基因在肺癌细胞中的表达水平,观察RSK4表达对肺癌细胞的细胞周期、凋亡以及侵袭能力的影响。同时观察调节RSK4表达对细胞的药物敏感性的影响<br>　　 方法：<br>　　 1)RSK4表达载体pcDNA3.1(-):RSK4基因载体的构建是将RSK4全长cDNA序列(no.NM_014496)插入pcDNA3.1/Neo(-)载体中,由Liao博士馈赠。<br>　　 2)RSK4表达质粒的中量制备:将pcDNA3.1(-)/RSK4和pcDNA3.1(-)/GFP质粒转染E.coli DH5α菌,鉴定阳性细菌克隆后用QIGEN plasmid Midikit进行中量提取。<br>　　 3)基因稳定表达细胞株的筛选:将pcDNA3.1(-)/RSK4质粒用Lipofectamine2000转染SPCA1和A549细胞后用G418进行筛选,建立RSK4基因高表达细胞株和对照细胞株。<br>　　 4)RNAi实验:合成RSK4 siRNh,通过瞬时转染RSK4高表达H460细胞,干扰目的基因的表达。<br>　　 5)RSK4m RNA表达水平的分析:半定量RT-PCR。<br>　　 6)RSK4蛋白表达水平的检测:Western Blot分析。<br>　　 7)药物敏感性实验:MTT法。<br>　　 8)细胞周期分析及凋亡实验:采用流式细胞检测技术测定细胞DNA含量,Modtif软件分析细胞周期。采用Annexin-V和DNA染色流式细胞仪分析细胞的凋亡情况。<br>　　 9)细胞侵袭性实验:用Transwell法检测细胞的侵袭性。<br>　　 结果：<br>　　 1)成功建立稳定表达RSK4的SPCA1和A549细胞,其RSK4 mRNA表达水平是对照细胞的9.5倍和8.2倍,蛋白表达水平也显著升高。<br>　　 2)RSK4 siRNA转染H460可显著降低mRNA和蛋白水平,RSK4 mRNA水平下调了84.1％,蛋白水平下调了85.7％。<br>　　 3)SPCA1/RSK4(+)和A549/RSK4(+)的凋亡率与亲本细胞相比略增高,但不显著。G0-G1期细胞比例增加。<br>　　 4)筛选的SPCA1/RSK4(+)和A549/RSK4(+)细胞透过Metrigel胶贴在Transwell小孔基底膜外侧的细胞数目比其相应的亲本细胞少,仅为亲本数目的1/5。<br>　　 5)SPCA1/RSK4(+)和A549/RSK4(+)对5-FU和ADM的敏感性均高于相应的亲本细胞,对MMC和DDP的敏感性与亲本细胞相当。<br>　　 6)下调RSK4表达,使NCL-H460细胞对四种药物的敏感性显著降低。<br>　　 结论：<br>　　 1)成功建立RSK4基因稳定表达的SPCA1/RSK4和A549/RSK4细胞株。<br>　　 2)RSK4基因高表达可以诱导细胞停留在G0-G1期、降低细胞的侵袭转移能力,对细胞凋亡影响不显著。增加对5-FU和ADM的敏感性,但对MMC和DDP的敏感性增加不明显。<br>　　 3)下调RSK4高表达的NCL-H460细胞的RSK4表达水平,可以显著降低其对5-FU、ADM、DDP和ADM敏感性。<br>　　 4)RSK4在肺癌的生物学功能更符合抑癌基因的表现,有望成为治疗的靶基因。