检索历史 清除

摘要辣椒(Capsicum annuum L.)和大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)是在我国广泛种植的重要蔬菜,病害及其它各种非生物逆境始终困扰着这些蔬菜生产,影响其产量、品质和效益。培育和推广应用抗逆性强的品种或者采取更为有效的管理措施以解决上述问题已经越来越迫切,作为上述技术策略的重要基础,开展蔬菜的抗逆分子机制研究,鉴定其基因组中具有重要应用价值的抗性基因并在蔬菜抗逆基因工程中加以应用已经引起了人们高度关注,成为国际生物学界当前十分活跃的研究领域。本研究选择在蔬菜抗逆(病)反应中可能起重要调节作用的辣椒疫霉激发子elicitin和大白菜乙烯应答因子(BpERF1),运用原核表达、酵母双杂交技术对两个辣椒疫霉elicitin基因进行初步功能研究以及通过亚细胞定位、瞬间表达技术和转基因烟草T2代抗逆分析研究大白菜BpERF1基因的功能,取得了以下研究结果:<br>　　 1.通过设计特异性引物和RT-PCR扩增,获得了2个辣椒疫霉elicitin基因的全长cDNA,其中elicitin7与大豆疫霉推定的elicitinSOJ3A有80％同源序列,elicitin24与辣椒疫霉capsicin有96％同源序列。上述2个elicitin激发子cDNA的推导氨基酸序列上均含有信号肽,都为酸性蛋白,都具有elicitin超家族保守的结构域。进一步聚类分析,结果表明上述2个激发子都属于α-elicitin。上述2个elicitin阳性克隆的原核表达产物都可诱导烟草K326产生过敏反应。<br>　　 2.运用Gateway克隆技术,以上述2个elicitin阳性克隆的cDNA为诱饵,构建了用于酵母双杂交的诱饵载体,3AT自激活检测结果显示这2个elicitin基因诱饵载体无自激活现象,其最低3AT浓度为50 mM。用上述2个诱饵载体筛选辣椒cDNA文库,2个elicitin蛋白分别筛选到了1个和10个互作蛋白的阳性克隆,经测序和同源性搜索,这11个阳性克隆分别是大豆冷调节基因类似蛋白(SRC2-like protein)、泛素连接酶相关蛋白(SGT1)、β-微管蛋白(beta,tubulin)、长链脂酰辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase 6)、生长素抑制蛋白(auxin-repressed protein)、推定的线粒体磷酸运载蛋白(putative mitochondrialphosphate carder protein)、光合放氧复合物(photosystem Ⅱ oxygen-evolvingcomplex protein 3)以及4个未知功能的蛋白。这些蛋白分别与植物防御反应、生长、钙离子流,蛋白降解、细胞骨架构成、脂肪酸代谢、光合作用以及呼吸作用有关。<br>　　 3.亚细胞定位结果显示BpERF1是一个核定位蛋白,瞬间表达分析结果表明BpERF1可结合GCC盒,但不能与DRE元件结合。用BpERF1超表达烟草T2代株系的植株分析BpERF1超表达对转基因烟草抗各种逆境胁迫的影响,结果发现BpERF1超表达对转基因植株耐高盐、干旱和低温等作用不明显,但可增强转基因植株对高温的敏感性。人工接种辣椒青枯病病原菌,结果发现BpERF1超表达可提高转基因烟草植株抗辣椒青枯病的水平,这与上述瞬间表达的结果即BpERF1可与GCC盒结合而不与DRE元件结合的结果是一致的,推测BpERF1可能主要参与对生物胁迫的防御反应。<br>　　 4.鉴于BpERF1超表达可提高转基因烟草对高温的敏感性,本研究进一步分析了BpERF1超表达提高转基因烟草对高温敏感性与活性氧代谢和细胞膜脂过氧化之间的可能关系。结果发现转基因烟草和对照均表现出MDA含量与APX活性呈上升趋势,而SOD、CAT呈下降趋势,POD活性则是呈先降后升的趋势。但是,BpERF1超表达的转基因植株中MDA量和H2O2的DAB染色显示显著高于野生型对照,而SOD、CAT和APX等活性氧清除系统都比对照低,POD活性在前期比对照高而后比对照低。这些结果表明BpERF1超表达提高转基因植株对高温敏感性可能与该基因超表达对活性氧代谢和膜脂过氧化的影响有关。