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摘要脱水蛋白是植物在脱水、低温、冷冻、渗透胁迫、脱落酸处理和种子成熟时积累的一类典型的具有独特免疫学特征的植物蛋白，属于LEA D11或LEAⅡ蛋白家族。CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding factor1)转录因子是CBF抗寒途径中的一个主控开关基因，可激活一系列包括脱水蛋白等抗寒功能基因的表达，提高植株的抗寒性。<br>　　红豆越桔（Vaccinium vitis-idaea L.）又称越桔，为杜鹃花科越桔属多年生常绿矮小灌木。分布于我国东北、新疆和北欧、北美等环北极地区。冬季可耐-50℃极端低温，是一种极其宝贵的抗寒资源，但对其抗寒机理了解甚少。为了解红豆越桔的抗寒机理，通过cDNA末端快速扩增（RACE）和基因组步移技术，我们克隆了红豆越桔CBF抗寒途径中的一个主控开关基因VviDREB1和它下游的一个功能蛋白基因VviCOR11。利用生物信息学分析了这两个基因及其启动子序列结构和功能，并进行了洋葱表皮细胞的亚细胞定位和荧光定量RT-PCR表达分析，在模式植物烟草（Nicotiana）中进行异源表达分析，并对其启动子做了缺失和瞬时表达实验，揭示了红豆越桔植物中CBF抗寒途径的存在及其部分抗寒机理，并为今后利用这两个抗寒相关基因进行观赏植物抗寒品种的改良提供理论依据。主要研究结果如下:<br>　　1通过同源克隆技术成功地克隆了红豆越桔KS型脱水蛋白VviCOR11基因的cDNA序列，全长567 bp，没有内含子，是一个编码108个氨基酸的亲水性蛋白。洋葱表皮细胞的亚细胞定位实验结果表明VviCOR11基因被定位在细胞核上。实时荧光定量RT-PCR实验结果表明，红豆越桔组培苗VviCOR11在常温下能够表达，并受低温、NaCl和ABA诱导，在12 h达到最大值，其中NaCl和ABA处理表达强烈，接近对照表达量的5倍和7倍。<br>　　2为探明红豆越桔VviCOR11基因的表达调控规律，在VviCOR11基因cDNA序列的基础上，应用接头介导的基因组步移技术，从红豆越桔中克隆了一条长1584 bp，包含有VviCOR11完整ORF序列的5'侧翼序列（GenBank登录号为FJ429387）。经PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有5UTR Pyrich stretch序列和启动子的特定结构，如TATA-box、CAAT-box等，保证转录的精确起始。在此序列中发现有ABRE、LTR、TC-rich repeats、ARE、MYB（或MYC）、TGACG-motif、CBFHV等多个潜在的与逆境有关的顺式作用元件，由此推测VviCOR11基因的表达可能受ABA和低温、干旱、高盐等胁迫诱导，并且可能是CBF转录因子调控的下游目标基因。对VviCOR11启动子5'端连续缺失瞬时表达实验的结果表明，启动子在翻译起始位点上游-217 bp处就表现了在叶片中有基础表达，而且随着启动子序列的延长，其启动活性也加强。在非诱导条件下，CP5∷GUS基因在烟草的根、茎、叶、花瓣及花柱中均有表达，这表明该启动子在各个器官中有基础表达的特点，说明VviCOR11可能不仅参与植物逆境调控，也可能参与植物生长发育等其它生命调节。<br>　　3我们将构建好的pVC4215载体通过农杆菌介导法转化烟草叶片，共得到27个Hyg抗性株系。经过PCR、RT-PCR、GUS染色和Hyg PCR检测验证，初步证实，VviCOR11基因已经完整整合到7个烟草株系的基因组中。经过生根、炼苗培养，发现转基因各株系的花期提前，叶片狭长。这可能是因为组成型表达VviCOR11的转基因烟草组织细胞液的浓度和ABA含量增加，使转基因烟草有利于成花。4℃低温处理20 h后，对植株进行了快速荧光诱导动力学曲线、电导率、MDA和脯氨酸含量等的测定，三个株系的脯氨酸含量比对照显著增加，其它生理指标差异不显著。<br>　　4本研究通过RACE和基因组步移技术从红豆越桔中克隆了一个DREB1基因，cDNA全长887 bp，命名为VviDREB1，其DNA序列3790 bp包含了1522 bp上游启动子序列。通过多重比对和进化树分析，该基因属于DREB亚家族中的A-1组即CBF小家族成员。通过SWISS MODEL同源建模结果显示，VviDREB1的DNA结合域(DNA-binding domain，DBD)与AtERF1的1gccA结构相同，也包含一个三股反向平行的β-折叠片和一个α-螺旋结构，并有结合DRE和GCC元件的潜力。洋葱表皮亚细胞定位是在细胞核上。通过PLACE和PlantCARE在线分析软件预测分析发现，VviDREB1启动子区序列中含有许多植物激素、非生物胁迫和光等相关作用元件或转录因子结合位点（Transcription factor binding locations，TFBs），其中MYCCON-SENSUSAT的CACATG基序可能是CBF表达诱导子ICE1(Inducer of CBF expression1)的主要结合基序。启动子瞬时表达实验表明VviDREB1在叶片中有基础表达特性。定量RT-PCR结果进一步表明，VviDREB1在常态下有一定量的表达，并可以被低温、高盐和ABA等诱导，并对低温反应迅速，在1h时达到最高峰，是对照的7倍左右;盐胁迫也在4h时达到最高峰，而且表达丰度是对照的17倍;ABA的最高峰虽在24h，但在0.5 h时就已超过了对照的5倍，在24 h时是对照的近15倍。<br>　　5为了研究VviDREB1在植物体中的异源表达特性，我们将构建好的pVB4215载体通过农杆菌介导法转化烟草，共得到25个Hyg抗性株系。经过PCR、RT-PCR、GUS染色和Hyg PCR检测验证，初步证实，VviDREB1基因已经完整整合到2个烟草株系的基因组中。DB25在4℃低温处理20 h后的快速荧光动力学曲线的分析结果表明，VviDREB1基因能够显著提高烟草的荧光产量，提高转基因植株的抗寒力。